347 12.7*1.24mm Tiub bergelung keluli tahan karat, Mekanisme molekul pemeluwapan elektrostatik segerak dan penggumpalan α-sinuklein dan tau

Terima kasih kerana melawat Nature.com.Anda menggunakan versi penyemak imbas dengan sokongan CSS terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami menunjukkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Peluncur menunjukkan tiga artikel setiap slaid.Gunakan butang belakang dan seterusnya untuk bergerak melalui slaid, atau butang pengawal slaid di hujung untuk bergerak melalui setiap slaid.

347 Spesifikasi Paip Keluli Tahan Karat

347 12.7*1.24mm Tiub bergelung keluli tahan karat

Diameter Luar: 6.00 mm OD sehingga 914.4 mm OD, Saiz sehingga 24" NB tersedia Bekas stok, Tiub Keluli Saiz OD tersedia Bekas stok

Julat Ketebalan Paip SS 347: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, dsb. (0.5-12mm) Atau saiz bukan sekata untuk disesuaikan mengikut keperluan

Jenis: SS 347 Paip Lancar |Paip SS 347 ERW |SS 347 Paip Dikimpal |SS 347 Paip Fabrikasi |Tiub SS 347 CDW, Paip LSAW / Dikimpal jahitan / Dilukis Semula

Bentuk: Paip/ Tiub Bulat SS 347, Paip/ Tiub SS 347 Square, Paip/ Tiub SS 347 Segi Empat, Tiub Bergelung SS 347, Bentuk "U" SS 347, Gegelung Kek Pan SS 347, Tiub Hidraulik SS 347

Panjang: Rawak Tunggal, Rawak Berganda & Hujung Panjang Diperlukan: Hujung Biasa, Hujung Serong, Tapak

Perlindungan Akhir: Penutup Plastik |Kemasan Luar: Kemasan Cermin 2B, No.4, No.1, No.8 untuk Paip Keluli Tahan Karat, Kemasan mengikut Keperluan pelanggan

Keadaan Penghantaran: Anil dan Jeruk, Digilap, Cerah Anil, Dilukis Sejuk

Pemeriksaan, Laporan Ujian: Sijil Ujian Kilang, EN 10204 3.1, Laporan Kimia, Laporan Mekanikal, Laporan Ujian PMI, Laporan Pemeriksaan Visual, Laporan Pemeriksaan Pihak Ketiga, Laporan Makmal yang Diluluskan NABL, Laporan Ujian Merosakkan, Laporan Ujian Tidak Memusnahkan

Pembungkusan: Dibungkus dalam Kotak Kayu, Beg Plastik, Jalur Keluli yang Dihimpun, atau mengikut Permintaan Pelanggan

Istimewa: Saiz dan Spesifikasi selain daripada di atas boleh dihasilkan atas permintaan

SS 347 Julat Saiz Paip:1/2 inci NB, OD hingga 24 inci

ASTM A312 347: Paip austenit dikimpal lancar dan jahitan lurus yang bertujuan untuk perkhidmatan menghakis suhu tinggi dan am.Logam pengisi tidak dibenarkan semasa mengimpal.

ASTM A358 347: Paip austenit dikimpal gabungan elektrik untuk perkhidmatan menghakis dan/atau suhu tinggi.Biasanya hanya paip sehingga 8 inci dihasilkan mengikut spesifikasi ini.Penambahan logam pengisi dibenarkan semasa mengimpal.

ASTM A790 347: Paip ferit/austenit (dupleks) yang dikimpal lancar dan lurus yang dikimpal untuk perkhidmatan mengakis am, dengan penekanan khusus pada ketahanan terhadap retakan kakisan tegasan.

ASTM A409 347: Jahitan lurus atau kelim lingkaran elektrik dikimpal paip dinding cahaya austenit diameter besar dalam saiz 14” hingga 30” dengan dinding Sch5S dan Sch 10S untuk menghakis dan/atau tinggi

ASTM A376 347: Paip austenit lancar untuk aplikasi suhu tinggi.

ASTM A813 347: Jahitan tunggal, paip austenit dikimpal tunggal atau dua kali untuk suhu tinggi dan aplikasi mengakis umum.

ASTM A814 347: Paip austenit yang dikimpal sejuk untuk suhu tinggi dan perkhidmatan menghakis am.

Komposisi Kimia Paip Keluli Tahan Karat 347H

Sifat Mekanikal Paip Keluli Tahan Karat 347H

Paip Keluli Tahan Karat 347H Sifat Fizikal

Gred Setara untuk Paip Keluli Tahan Karat 347H

Agregasi amiloid alpha-synuclein (αS) adalah ciri khas penyakit Parkinson dan synucleinopathies lain.Baru-baru ini, protein tau yang biasanya dikaitkan dengan penyakit Alzheimer telah dikaitkan dengan patologi αS dan didapati menyetempat bersama dalam kemasukan yang kaya dengan αS, walaupun mekanisme molekul penggumpalan kedua-dua protein masih tidak jelas.Kami melaporkan di sini bahawa fasa αS memisahkan kepada kondensat cecair melalui pemeluwapan kompleks elektrostatik dengan polipeptida bercas positif seperti tau.Bergantung pada pertalian αS untuk polikasi dan kadar penyusutan valensi rangkaian pembekuan, bekuan mengalami pembekuan atau penggabungan yang cepat diikuti oleh pengagregatan amiloid yang perlahan.Dengan menggabungkan satu set teknik biofizikal lanjutan, kami dapat mencirikan pemisahan fasa cecair-cecair αS/Tau dan mengenal pasti faktor utama yang membawa kepada pembentukan agregat heterogen yang mengandungi kedua-dua protein dalam kondensat protein cecair.
Sebagai tambahan kepada petak membran, pemisahan ruang dalam sel juga boleh dicapai dengan pembentukan badan padat yang kaya dengan protein, seperti cecair yang dipanggil pemeluwapan atau titisan biomolekul, melalui proses yang dikenali sebagai pemisahan fasa cecair-cecair (LLPS).Titisan ini dibentuk oleh interaksi temporal multivalen, biasanya antara protein atau protein dan RNA, dan melayani pelbagai fungsi dalam hampir semua sistem hidup.Sebilangan besar protein berkeupayaan LLP mempamerkan urutan kerumitan rendah yang sangat tidak teratur sifatnya dan dalam pembentukan kondensat biomolekul3,4,5.Banyak kajian eksperimen telah mendedahkan sifat fleksibel, sering tidak teratur, dan multivalen bagi protein yang membentuk kondensat seperti cecair ini, walaupun sedikit diketahui tentang penentu molekul tertentu yang mengawal pertumbuhan dan kematangan kondensat ini kepada yang lebih pepejal. negeri..
Data baharu menyokong hipotesis bahawa LLPS dipacu protein yang menyimpang dan transformasi titisan kepada struktur pepejal mungkin merupakan laluan selular yang relevan yang membawa kepada pembentukan agregat toksik tidak larut yang sering menjadi ciri penyakit degeneratif.Banyak protein bercelaru intrinsik (IDP) yang berkaitan dengan LLPS, selalunya bercas tinggi dan fleksibel, telah lama dikaitkan dengan neurodegenerasi melalui proses pengagregatan amiloid.Khususnya, kondensat IDP biomolekul seperti FUS7 atau TDP-438 atau protein dengan domain kerumitan rendah yang besar seperti hnRNPA19 telah ditunjukkan menua menjadi bentuk seperti gel atau bahkan pepejal melalui proses yang dipanggil pencairan.kompaun.kepada peralihan fasa pepejal (LSPT) sebagai fungsi masa atau sebagai tindak balas kepada pengubahsuaian pasca translasi tertentu atau mutasi penting secara patologi1,7.
Satu lagi IDP yang dikaitkan dengan LLPS dalam vivo ialah Tau, protein tidak teratur yang berkaitan dengan mikrotubule yang pengagregatan amiloidnya telah dikaitkan dengan penyakit Alzheimer10 tetapi baru-baru ini juga telah dikaitkan dengan penyakit Parkinson (PD) dan proteinopati nuklear sinaptik lain 11, 12, 13 berkaitan.Tau telah ditunjukkan secara spontan berpisah daripada larutan/sitoplasma disebabkan oleh interaksi elektrostatik yang menggalakkan14, mengakibatkan pembentukan titisan yang diperkaya tau yang dikenali sebagai coacervates elektrostatik.Ia juga telah diperhatikan bahawa jenis interaksi tidak spesifik ini adalah daya penggerak di sebalik banyak kondensat biomolekul dalam alam semula jadi15.Dalam kes protein tau, pengagregatan elektrostatik boleh dibentuk melalui pengagregatan mudah, di mana kawasan protein yang bercas bertentangan mencetuskan proses pembelahan, atau oleh pengagregatan kompleks melalui interaksi dengan polimer bercas negatif seperti RNA.
Baru-baru ini, α-synuclein (αS), IDP amiloid yang terlibat dalam PD dan penyakit neurodegeneratif lain yang secara kolektif dikenali sebagai synucleinopathy17,18, telah ditunjukkan dalam model selular dan haiwan19,20 tertumpu dalam kondensat protein dengan tingkah laku seperti bendalir.Kajian in vitro telah menunjukkan bahawa αS menjalani LLPS melalui pengagregatan mudah melalui interaksi hidrofobik yang kebanyakannya, walaupun proses ini memerlukan kepekatan protein yang sangat tinggi dan masa pengeraman yang tidak biasa19,21.Sama ada kondensat yang mengandungi αS yang diperhatikan dalam vivo dibentuk oleh ini atau proses LLPS lain kekal sebagai isu utama yang tidak dapat diselesaikan.Begitu juga, walaupun pengagregatan amiloid αS telah diperhatikan dalam neuron dalam PD dan synucleinopathies lain, mekanisme yang tepat di mana αS menjalani pengagregatan amiloid intraselular masih tidak jelas, kerana ekspresi berlebihan protein ini nampaknya tidak mencetuskan proses ini dengan sendirinya.Kerosakan selular tambahan selalunya diperlukan, menunjukkan bahawa lokasi selular tertentu atau persekitaran mikro diperlukan untuk renukleasi himpunan amiloid αS intraselular.Satu persekitaran selular yang sangat terdedah kepada pengagregatan mungkin bahagian dalam kondensat protein 23 .
Menariknya, αS dan tau telah didapati menyetempat bersama dalam kemasukan penyakit ciri pada manusia dengan penyakit Parkinson dan synucleinopathies lain 24,25 dan eksperimen telah melaporkan hubungan patologi sinergistik antara kedua-dua protein 26,27 menunjukkan potensi hubungan antara pengagregatan αS dan tau dalam penyakit neurodegenerative.penyakit.αS dan tau telah didapati berinteraksi dan menggalakkan pengagregatan antara satu sama lain secara in vitro dan in vivo 28,29 dan agregat heterogen yang terdiri daripada kedua-dua protein ini telah diperhatikan dalam otak pesakit dengan synucleinopathies 30 .Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang asas molekul interaksi antara αS dan tau dan mekanisme pengagregatan bersamanya.αS telah dilaporkan berinteraksi dengan tau melalui tarikan elektrostatik antara kawasan terminal C yang sangat negatif αS dan kawasan tau yang kaya dengan prolin pusat, yang juga diperkaya dengan residu bercas positif.
Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa αS sememangnya boleh berpecah menjadi titisan melalui pemeluwapan kompleks elektrostatik dengan kehadiran protein tau, berbeza dengan interaksinya dengan polipeptida bercas positif lain seperti poli-L-lisin (pLK), dan dalam proses ini .αS bertindak sebagai molekul perancah untuk rangkaian titisan.Kami telah mengenal pasti perbezaan ketara dalam proses pematangan αS coacervates elektrostatik, yang dikaitkan dengan perbezaan dalam valensi dan kekuatan interaksi protein yang terlibat dalam rangkaian coacervate.Menariknya, kami memerhatikan pengagregatan bersama protein αS dan tau amyloid dalam coacervates cecair jangka panjang dan mengenal pasti beberapa faktor utama yang membawa kepada pengagregatan bersama kedua-dua protein ini dalam coacervates tersebut.Di sini kami menerangkan secara terperinci proses ini, yang merupakan mekanisme molekul yang mungkin mendasari kolokalisasi dua protein dalam kemasukan khusus penyakit.
αS mempunyai ekor terminal C yang sangat anionik pada pH neutral (Rajah 1a), dan kami membuat hipotesis bahawa ia boleh menjalani LLPS melalui pemeluwapan kompleks elektrostatik dengan molekul polipeptida bercelaru polikationik.Kami menggunakan 100-residu poli-L-lisin (pLK) sebagai molekul model permulaan kerana sifat polimernya yang bercas positif dan tidak teratur pada pH neutral 32. Pertama, kami mengesahkan bahawa pLK berinteraksi dengan domain Ct αS melalui spektroskopi NMR Solution (Rajah 1b) menggunakan αS berlabel 13C/15N dengan kehadiran peningkatan nisbah molar αS:pLK.Interaksi pLK dengan domain Ct αS menunjukkan dirinya dalam gangguan peralihan kimia dan penurunan keamatan puncak di rantau protein ini.Menariknya, apabila kita mencampurkan αS dengan pLK pada kepekatan αS lebih kurang.5–25 µM dengan kehadiran polietilena glikol (5–15% PEG-8) (penampan LLPS tipikal: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) kami segera melalui bidang pembentukan protein yang luas .titisan diperhatikan menggunakan mikroskop pendarfluor (WF) dan medan terang (BF) (Rajah 1c).Titisan 1-5 µm yang mengandungi αS pekat (tambah 1 µM AlexaFluor488 berlabel αS, AF488-αS), sifat elektrostatiknya boleh diperoleh daripada rintangannya kepada 10% 1,6-heksanediol (1,6-HD) dan kepekaannya terhadap peningkatan dalam kepekatan NaCl (Rajah 1c).Sifat seperti bendalir bagi coacervates kompleks elektrostatik αS/pLK ditunjukkan oleh keupayaan mereka untuk bercantum dalam milisaat (Rajah 1d).Menggunakan turbidimetri, kami mengukur pembentukan titisan di bawah keadaan ini, mengesahkan sifat elektrostatik interaksi utama yang berkaitan dengan kestabilannya (Rajah 1e), dan menilai kesan pelbagai nisbah polimer pada proses LLPS (Rajah 1f).Walaupun pembentukan titisan diperhatikan pada julat nisbah polimer yang luas, prosesnya sangat menguntungkan apabila pLK melebihi αS.LLP juga telah diperhatikan menggunakan agen penyesaran berbeza secara kimia dextran-70 (70 kDa) atau menggunakan pelbagai format sampel, termasuk titisan slaid kaca, telaga mikroplat pelbagai bahan, Eppendorf atau kapilari kuarza.
Perwakilan skematik kawasan protein yang berbeza dalam varian WT-αS dan ΔCt-αS yang digunakan dalam kajian ini.Domain N-terminal amphipathic, rantau pembentuk amiloid hidrofobik (NAC), dan domain terminal C bercas negatif ditunjukkan dalam warna biru, oren dan merah, masing-masing.Peta Net Charge Per Residual (NCPR) WT-αS ditunjukkan.b Analisis NMR interaksi αS/pLK tanpa adanya rumpun makromolekul.Apabila kepekatan pLK meningkat (αS:pLK nisbah molar 1:0.5, 1:1.5, dan 1:10 ditunjukkan dalam warna hijau muda, hijau dan hijau gelap, masing-masing).c Coacervate αS/pLK (nisbah molar 1:10) pada 25 µM (1 µM AF488 berlabel αS atau pLK berlabel Atto647N untuk pengimejan WF) dalam penimbal LLPS (atas) atau ditambah dengan 500 mM NaCl (kiri bawah) atau selepas 10 % 1,6-heksanediol (1,6-HD; kanan bawah).Bar skala = 20 µm.d Imej mikroskopik perwakilan gabungan titisan BF αS/pLK (nisbah molar 1:10) pada kepekatan 25 μM;anak panah menunjukkan penggabungan titisan individu (anak panah merah dan kuning) ke dalam titisan baharu (anak panah oren) dalam masa 200 ms).Bar skala = 20 µm.e Penyerakan cahaya (pada 350 nm) Pengagregatan αS/pLK dalam penimbal LLPS sebelum dan selepas penambahan 500 mM NaCl atau 10% 1,6-HD pada 25 µM αS (N = 3 replika sampel, min dan sisihan piawai juga ditunjukkan).f BF imej (atas) dan analisis serakan cahaya (pada 350 nm, bawah) pengagregatan αS/pLK pada 25 μM αS dengan peningkatan nisbah molar αS:pLK (N = 3 ulangan sampel, min dan sisihan piawai juga ditunjukkan).Bar skala = 10 µm.Bar skala pada satu imej menunjukkan skala semua imej dalam satu panel.Data mentah disediakan dalam bentuk fail data mentah.
Berdasarkan pemerhatian kami terhadap pemeluwapan kompleks elektrostatik αS / pLK dan pemerhatian sebelumnya terhadap αS sebagai molekul pelanggan kondensat tau / RNA melalui interaksi langsung dengan tau31, kami membuat hipotesis bahawa αS dan tau boleh mengasingkan bersama dengan pelarut tanpa ketiadaan RNA pemeluwapan.melalui kompleks elektrostatik, dan αS ialah protein perancah dalam αS/Tau coacervates (lihat taburan cas tau dalam Rajah 2e).Kami mendapati bahawa apabila 10 μM αS dan 10 μM Tau441 (mengandungi 1 μM AF488-αS dan 1 μM Atto647N-Tau, masing-masing) dicampur bersama dalam penampan LLPS, mereka mudah membentuk agregat protein yang mengandungi kedua-dua protein, seperti yang dilihat oleh mikroskop WF.(Gamb. 2a).Kolokalisasi kedua-dua protein dalam titisan telah disahkan oleh mikroskop confocal (CF) (Tambahan Rajah 1a).Tingkah laku yang sama diperhatikan apabila dextran-70 digunakan sebagai agen pengagregatan (Tambahan Rajah 1c).Menggunakan sama ada PEG atau dextran berlabel FITC, kami mendapati bahawa kedua-dua ejen crowding diagihkan sama rata merentas sampel, tidak menunjukkan pengasingan mahupun perkaitan (Tambahan Rajah 1d).Sebaliknya, ia mencadangkan bahawa dalam sistem ini mereka menggalakkan pemisahan fasa melalui kesan kesesakan makromolekul, kerana PEG adalah agen kesesakan yang lebih disukai, seperti yang dilihat dalam sistem LLP lain33,34.Titisan kaya protein ini sensitif kepada NaCl (1 M) tetapi tidak kepada 1,6-HD (10% v/v), mengesahkan sifat elektrostatiknya (Tambahan Rajah 2a, b).Tingkah laku bendalir mereka telah disahkan dengan memerhati peristiwa titisan penggabungan milisaat menggunakan mikroskop BF (Rajah 2b).
imej mikroskop Confocal (CF) αS/Tau441 bersatu dalam penimbal LLPS (10 μM setiap protein, 0.5 μM αS berlabel AF488 dan Tau441 berlabel Atto647N).b Imej kontras gangguan pembezaan perwakilan (DIC) bagi peristiwa gabungan titisan αS/Tau441 (10 μM untuk setiap protein).c Gambar rajah fasa berdasarkan penyerakan cahaya (pada 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) dalam ketiadaan (kiri) atau kehadiran (kanan) 50 µM αS.Warna yang lebih panas menunjukkan lebih banyak serakan.d Penyerakan cahaya sampel αS/Tau441 LLPS dengan peningkatan kepekatan αS (Tau441 pada 5 µM, N = 2–3 ulangan sampel seperti yang ditunjukkan).e Perwakilan skematik beberapa varian protein tau dan kawasan berlainan protein yang digunakan dalam kajian ini: domain terminal N bercas negatif (merah), kawasan kaya prolin (biru), domain pengikat mikrotubule (MTBD, diserlahkan dalam oren), dan lingkaran pasangan pembentuk amiloid.kawasan filamen (PHF) yang terletak di dalam MTBD (kelabu).Peta Caj Setiap Residu Bersih (NCPR) Tau441 ditunjukkan.f Menggunakan 1 µM AF488 berlabel αS dan Atto647N berlabel ΔNt-, menggunakan 1 µM AF488 berlabel αS atau ΔCt-αS dengan kehadiran ΔNt-Tau (atas, 10 µM setiap protein) atau K18 (bawah, 50 µM ) ) ) mikrograf WF dipekatkan dalam penimbal LLPS atau K18.Bar skala dalam satu imej mewakili skala semua imej dalam satu panel (20 µm untuk panel a, b dan f).Data mentah untuk panel c dan d disediakan sebagai fail data mentah.
Untuk menguji peranan αS dalam proses LLPS ini, kami mula-mula menyiasat kesan αS pada kestabilan titisan oleh nephelometry menggunakan peningkatan kepekatan NaCl (Rajah 2c).Semakin tinggi kepekatan garam dalam sampel yang mengandungi αS, semakin tinggi nilai serakan cahaya (pada 350 nm), yang menunjukkan peranan penstabilan αS dalam sistem LLPS ini.Kesan yang sama boleh diperhatikan dengan meningkatkan kepekatan αS (dan seterusnya nisbah αS:Tau441) kepada lebih kurang.Peningkatan 10 kali ganda berbanding kepekatan tau (5 µM) (Rajah 2d).Untuk menunjukkan bahawa αS ialah protein perancah dalam coacervates, kami memutuskan untuk menyiasat kelakuan mutan Tau yang terganggu LLPS, yang tidak mempunyai rantau N-terminal bercas negatif (sisa 1-150, lihat Rajah 2e) dipanggil ΔNt-Tau.Mikroskopi dan nephelometry WF mengesahkan bahawa ΔNt-Tau sendiri tidak menjalani LLPS (Rajah 2f dan Rajah Tambahan 2d), seperti yang dilaporkan sebelum ini 14. Walau bagaimanapun, apabila αS ditambah kepada penyelesaian penyebaran varian Tau yang dipotong ini, proses LLPS adalah sepenuhnya. dipulihkan dengan ketumpatan titisan yang hampir dengan ketumpatan titisan larutan bersaiz penuh Tau dan αS di bawah keadaan dan kepekatan protein yang serupa.Proses ini juga boleh diperhatikan dalam keadaan sesak makromolekul rendah (Tambahan Rajah 2c).Peranan rantau C-terminal αS, tetapi bukan keseluruhan panjangnya, dalam proses LLPS ditunjukkan dengan perencatan pembentukan titisan menggunakan varian αS terpotong C-terminal yang tidak mempunyai residu 104-140 (Rajah 1a) daripada (ΔCt- protein αS) (Rajah 2f dan Rajah Tambahan 2d).Kolokalisasi αS dan ΔNt-Tau telah disahkan oleh mikroskop pendarfluor confocal (Tambahan Rajah 1b).
Untuk menguji lagi mekanisme LLPS antara Tau441 dan αS, varian Tau tambahan telah digunakan, iaitu serpihan teras filamen heliks (PHF) berpasangan dalam domain pengikat mikrotubulus (MTBD), yang jika ia mengandungi empat domain ulangan ciri, biasanya juga dikenali. sebagai serpihan K18 (lihat Rajah 2e).Baru-baru ini telah dilaporkan bahawa αS lebih suka mengikat kepada protein tau yang terletak dalam domain yang kaya dengan prolin dalam urutan yang mendahului domain pengikat mikrotubule.Walau bagaimanapun, rantau PHF juga kaya dengan residu bercas positif (lihat Rajah 2e), terutamanya lisin (sisa 15%), yang mendorong kami untuk menguji sama ada rantau ini turut menyumbang kepada pemeluwapan kompleks αS/Tau.Kami mendapati bahawa K18 sahaja tidak boleh mencetuskan LLPS pada kepekatan sehingga 100 μM di bawah keadaan yang diuji (penampan LLPS dengan 15% PEG atau 20% dextran) (Rajah 2f).Walau bagaimanapun, apabila kita menambah 50 µM αS kepada 50 µM K18, pembentukan cepat titisan protein yang mengandungi K18 dan αS diperhatikan oleh nephelometry (Tambahan Rajah 2d) dan mikroskop WF (Rajah 2f).Seperti yang dijangkakan, ΔCt-αS tidak dapat memulihkan tingkah laku LLPS K18 (Rajah 2f).Kami perhatikan bahawa pengagregatan αS/K18 memerlukan kepekatan protein yang lebih tinggi sedikit untuk mendorong LLPS berbanding dengan αS/ΔNt-Tau atau αS/Tau441, perkara lain adalah sama.Ini selaras dengan interaksi yang lebih kuat di rantau αS C-terminal dengan domain Tau yang kaya dengan prolin berbanding dengan domain pengikat mikrotubule, seperti yang diterangkan sebelum ini 31 .
Memandangkan ΔNt-Tau tidak boleh melaksanakan LLPS tanpa ketiadaan αS, kami memilih varian Tau ini sebagai model untuk mencirikan αS/Tau LLPS memandangkan kesederhanaannya dalam sistem LLPS dengan Tau penuh (isotype, Tau441/Tau441).dengan proses pengagregatan kompleks (heterotip, αS/Tau441).Kami membandingkan tahap pengagregatan αS (sebagai sebahagian daripada protein fasa pekat, fαS, c) dalam sistem αS/Tau dan αS/ΔNt-Tau dengan sentrifugasi dan analisis SDS-PAGE fasa tersebar (lihat 2e), mendapati nilai yang hampir sama. untuk semua protein pada kepekatan yang sama.Khususnya, kami memperoleh fαS, c 84 ± 2% dan 79 ± 7% untuk αS/Tau dan αS/ΔNt-Tau, masing-masing, menunjukkan bahawa interaksi heterotip antara αS dan tau adalah lebih tinggi daripada interaksi antara molekul tau.antara.
Interaksi dengan pelbagai polikasi dan kesan proses pemeluwapan pada kinetik αS pertama kali dikaji oleh kaedah pemulihan pendarfluor selepas pelunturan foto (FRAP).Kami menguji αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau dan αS/pLK coacervates (100 μM αS ditambah dengan 2 μM αS AF488-αS dan 100 μM Tau441 atau ΔNt-Tau atau 1 mM pLK).Data diperolehi dalam tempoh 30 minit pertama selepas mencampurkan komponen sampel.Daripada imej FRAP wakil (Rajah 3a, pemeluwapan αS/Tau441) dan lengkung kursus masa yang sepadan (Rajah 3b, Rajah Tambahan 3), dapat dilihat bahawa kinetik αS sangat serupa dengan coacervates Tau441.dan ΔNt-Tau, yang jauh lebih pantas dengan pLK.Pekali resapan yang dikira untuk αS di dalam coacervate mengikut FRAP (seperti yang diterangkan oleh Kang et al. 35) ialah D = 0.013 ± 0.009 µm2/s dan D = 0.026 ± 0.008 µm2/s untuk αS/TauS/s untuk αS/TauS441 sistem αS/.pLK, Tau dan D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, masing-masing (Rajah 3c).Walau bagaimanapun, pekali resapan αS dalam fasa tersebar adalah beberapa susunan magnitud yang lebih tinggi daripada semua fasa terkondensasi, seperti yang ditentukan oleh Spektroskopi Korelasi Pendarfluor (FCS, lihat Rajah Tambahan 3) di bawah keadaan yang sama (penampan LLPS) tetapi tanpa ketiadaan polikasi. ( D = 8 ± 4 µm2/s).Oleh itu, kinetik terjemahan αS dikurangkan dengan ketara dalam coacervates berbanding protein dalam fasa tersebar disebabkan oleh kesan kesesakan molekul yang ketara, walaupun semua coacervates mengekalkan sifat seperti cecair dalam setengah jam pertama selepas pembentukannya, berbeza dengan fasa tau.kinetik lebih cepat dalam kondensat pLK.
a–c FRAP analisis dinamik αS (2% AF488 berlabel αS) dalam coacervates elektrostatik.Imej perwakilan ujian αS/Tau441 FRAP dalam tiga kali ganda ditunjukkan dalam (a), di mana bulatan merah menunjukkan kawasan yang dinyahwarna.Bar skala ialah 5 µm.b Purata lengkung FRAP dan (c) pekali resapan yang dikira (D) untuk 5–6 (N) titisan berbeza daripada tiga eksperimen menggunakan 100 µM αS dan kepekatan equimolar Tau441 (merah) atau ΔNt-Tau (biru) atau pLK (hijau) pada sepuluh kali ganda kepekatan LLPS.Sisihan piawai keluk FRAP ditunjukkan dalam warna berlorek.Sebagai perbandingan, pekali resapan αS dalam fasa tersebar ditentukan dalam tiga kali ganda menggunakan spektroskopi korelasi pendarfluor (FCS) (lihat Rajah Tambahan 3 dan kaedah untuk maklumat lanjut).d Spektrum EPR jalur X berterusan 100 μM TEMPOL-122-αS dalam penimbal LLPS tanpa sebarang polikasi (hitam) atau dengan kehadiran 100 μM Tau441 (merah) atau ΔNt-Tau (biru) atau 1 mM pLK (hijau).Inset menunjukkan pandangan yang diperbesarkan bagi garis medan yang kuat di mana perubahan paling dramatik berlaku.e Mengikat lengkung 50 μM TEMPOL-122-αS dengan pelbagai polikasi jika tiada LLPS (tiada PEG).Pengurangan amplitud jalur III berbanding jalur II (IIII/III) spektrum EPR ternormal ditunjukkan untuk meningkatkan nisbah molar Tau441 (merah), ΔNt-Tau (biru) dan pLK (hijau).Garis berwarna menunjukkan kesesuaian kepada data menggunakan model pengikatan kasar dengan n tapak pengikatan yang sama dan bebas pada setiap lengkung.Data mentah disediakan dalam bentuk fail data mentah.
Sebagai pelengkap, kami menyiasat dinamik αS dalam pelbagai coacervates menggunakan pelabelan putaran terarah (SDSL) dan resonans paramagnetik elektron berterusan (CW-EPR).Kaedah ini telah terbukti sangat berguna dalam melaporkan fleksibiliti dan dinamik IDP dengan resolusi baki realistik36,37,38.Untuk tujuan ini, kami membina sisa sistein dalam mutan Cys tunggal dan menggunakan probe putaran 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Derivatif maleimide melabelkannya.Lebih khusus lagi, kami memasukkan probe TEMPOL pada kedudukan 122 atau 24 αS (TEMPOL-122-αS dan TEMPOL-24-αS).Dalam kes pertama, kami menyasarkan kawasan terminal C protein, yang terlibat dalam interaksi dengan polikasi.Sebaliknya, kedudukan 24 boleh memberi kita maklumat tentang dinamik keseluruhan protein dalam kondensat.Dalam kedua-dua kes, isyarat EPR yang diperoleh untuk protein fasa tersebar sepadan dengan radikal nitroksida dalam keadaan bergerak pantas.Selepas pemisahan fasa dengan kehadiran tau atau pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 atau ΔNt-Tau pada nisbah 1:1 atau pLK pada nisbah 1:10), peningkatan dalam keamatan puncak relatif diperhatikan dalam spektrum EPR αS.Garis kehilangan meluas, menunjukkan pengurangan kinetik orientasi semula αS dalam titisan berbanding protein dalam fasa cair (Rajah 3d, Rajah Tambahan 4a).Perubahan ini lebih ketara pada kedudukan 122. Manakala pada kedudukan 24 kehadiran pLK tidak menjejaskan kinetik probe, pada kedudukan 122 bentuk garis spektrum berubah dengan ketara (Tambahan Rajah 4a).Apabila kami cuba memodelkan spektrum pada kedudukan 122 dua sistem αS/polycation menggunakan model isotropik (Tambahan Rajah 5a) yang biasa digunakan untuk menerangkan dinamik IDP38,39 berlabel spin, kami tidak dapat membina semula spektrum eksperimen..Simulasi spektrum kedudukan 24 putaran berbeza (Tambahan Rajah 5a).Ini menunjukkan bahawa terdapat kedudukan keutamaan dalam ruang konfigurasi putaran rantau C-terminal αS dengan kehadiran polikasi.Apabila mempertimbangkan pecahan αS dalam fasa pekat di bawah keadaan EPR percubaan (84 ± 2%, 79 ± 7%, dan 47 ± 4% untuk αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, dan αS/pLK, masing-masing—lihat Tambahan Rajah 2e analisis data c), dapat dilihat bahawa pelebaran yang dikesan oleh kaedah EPR terutamanya mencerminkan interaksi kawasan terminal-C αS dengan pelbagai polikasi dalam fasa pekat (perubahan utama apabila menggunakan TEMPOL-122- αS), dan bukan pemeluwapan protein.Peningkatan dalam mikroviskositi diperhatikan dalam probe.Seperti yang dijangkakan, spektrum EPR protein di bawah keadaan selain LLPS telah dipulihkan sepenuhnya apabila 1 M NaCl ditambah kepada campuran (Tambahan Rajah 4b).Secara keseluruhannya, data kami mencadangkan bahawa perubahan yang dikesan oleh CW-EPR terutamanya mencerminkan interaksi kawasan terminal C αS dengan pelbagai polikasi dalam fasa pekat, dan interaksi ini nampaknya lebih kuat dengan pLK berbanding dengan Tau.
Untuk mendapatkan lebih banyak maklumat struktur tentang protein dalam coacervate, kami memutuskan untuk mengkaji sistem LLPS menggunakan NMR dalam larutan.Walau bagaimanapun, kami hanya dapat mengesan pecahan αS yang tinggal dalam fasa tersebar, yang mungkin disebabkan oleh pengurangan dinamik protein di dalam coacervate dan fasa padat di bahagian bawah larutan dalam analisis NMR.Apabila kami menganalisis struktur dan dinamik protein yang tinggal dalam fasa tersebar sampel LLPS menggunakan NMR (Tambahan Rajah 5c, d), kami mendapati bahawa protein berkelakuan hampir sama dengan kehadiran pLK dan ΔNt-Tau, kedua-dua yang berada dalam struktur sekunder dan dinamik tulang belakang protein, yang didedahkan oleh eksperimen pada anjakan kimia sekunder dan kelonggaran R1ρ.Data NMR menunjukkan bahawa terminal-C αS mengalami kehilangan fleksibiliti konformasi yang ketara sambil mengekalkan sifat tidak teraturnya, seperti jujukan protein yang lain, disebabkan interaksinya dengan polikasi.
Oleh kerana peluasan isyarat CW-EPR yang diperhatikan dalam fasa pekat TEMPOL-122-αS mencerminkan interaksi protein dengan polikasi, kami melakukan titrasi EPR untuk menilai pertalian pengikatan αS kepada pelbagai polikasi tanpa ketiadaan LLPS (tiada pengumpulan Penampan LLPS), menunjukkan bahawa interaksi adalah sama dalam fasa cair dan pekat (yang disahkan oleh data kami, Rajah Tambahan 4a dan Rajah Tambahan 6).Matlamatnya adalah untuk melihat sama ada semua coacervates, walaupun sifat seperti bendalir biasa mereka, mempamerkan sebarang kelakuan pembezaan asas pada tahap molekul.Seperti yang dijangkakan, spektrum EPR meluas dengan peningkatan kepekatan polikasi, mencerminkan penurunan dalam fleksibiliti molekul disebabkan oleh interaksi molekul semua rakan interaksi hampir kepada tepu (Rajah 3e, Rajah Tambahan 6).pLK mencapai ketepuan ini pada nisbah molar yang lebih rendah (polycation:αS) berbanding dengan ΔNt-Tau dan Tau441.Malah, perbandingan data dengan model pengikatan anggaran dengan mengandaikan n tapak pengikatan yang sama dan bebas menunjukkan bahawa pemalar pemisahan ketara bagi pLK (~5 μM) adalah susunan magnitud yang lebih rendah daripada Tau441 atau ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Walaupun ini adalah anggaran kasar, ini menunjukkan bahawa αS mempunyai pertalian yang lebih tinggi untuk polikasi yang lebih mudah dengan kawasan cas positif berterusan.Memandangkan perbezaan ini dalam pertalian antara αS dan pelbagai polikasi, kami membuat hipotesis bahawa sifat cecair mereka mungkin berubah secara berbeza dari semasa ke semasa dan dengan itu mengalami proses LSPT yang berbeza.
Memandangkan persekitaran yang sangat sesak dalam coacervate protein dan sifat amiloid protein, kami memerhatikan tingkah laku coacervate dari semasa ke semasa untuk mengesan kemungkinan proses LSPT.Menggunakan mikroskop BF dan CF (Rajah 4), kami mendapati bahawa αS/Tau441 menyatukan sebahagian besar dalam larutan, membentuk titisan besar yang menyentuh dan membasahi permukaan di bahagian bawah telaga/gelongsor sebagai titisan penuh, seperti yang dijangkakan (Tambahan Rajah 7d);kami memanggil struktur berbentuk bawah ini "rakit protein".Struktur ini kekal cair kerana ia mengekalkan keupayaan untuk bercantum (Tambahan Rajah 7b) dan boleh dilihat selama beberapa jam selepas LLPS dicetuskan (Rajah 4 dan Tambahan Rajah 7c).Kami memerhatikan bahawa proses pembasahan lebih disukai pada permukaan bahan hidrofilik dan bukannya hidrofobik (Tambahan Rajah 7a), seperti yang dijangkakan untuk coacervates elektrostatik dengan cas tidak seimbang dan dengan itu potensi permukaan elektrostatik yang tinggi.Terutama, gabungan αS/ΔNt-Tau dan berakit telah dikurangkan dengan ketara, manakala kondensat αS/pLK berkurangan dengan ketara (Rajah 4).Semasa masa pengeraman yang singkat, titisan αS/pLK dapat menyatu dan membasahi permukaan hidrofilik, tetapi proses ini dengan cepat berhenti dan selepas 5 jam pengeraman, hanya peristiwa penggabungan terhad dan tiada pembasahan diperhatikan.– peralihan gel-titisan.
Perwakilan BF (panel skala kelabu) dan CF (panel kanan, AF488 berlabel αS dalam warna hijau) sampel coacervate yang mengandungi 100 µM αS (1% label pendarfluor) dalam penimbal LLPS dengan kehadiran imej mikroskopik 100 µM Tau441 (atas) pendarfluor) -Tau (tengah) atau 1 mM pLK (bawah) pada masa pengeraman dan ketinggian fokus yang berbeza (z, jarak dari bahagian bawah telaga plat).Eksperimen diulang 4-6 kali secara bebas antara satu sama lain dengan keputusan yang sama.Coacervates αS/Tau441 dibasahi selepas 24 jam, membentuk rakit yang lebih besar daripada imej.Bar skala untuk semua imej ialah 20 µm.
Kami kemudian bertanya sama ada kolam protein seperti cecair besar yang terbentuk dalam αS / Tau441 LLPS akan membawa kepada pengagregatan amiloid mana-mana protein yang dikaji.Kami mengikuti kematangan titisan αS/Tau441 dari semasa ke semasa dengan mikroskop WF di bawah keadaan yang sama seperti di atas, tetapi menggunakan 1 μM AF488 berlabel αS dan Atto647N berlabel Tau441 (Rajah 5a).Seperti yang dijangkakan, kami memerhatikan penyetempatan protein lengkap sepanjang proses pematangan.Menariknya, dari ca.Selepas 5 jam, struktur bukan bulatan yang lebih sengit diperhatikan di dalam rakit, yang kami panggil "titik", sebahagian daripadanya dikolokalisasikan dengan αS, dan sebahagiannya diperkayakan dalam Tau441 (Rajah 5a, anak panah putih).Tompok-tompok ini sentiasa diperhatikan dalam rakit pada tahap yang lebih besar untuk αS/ΔNt-Tau berbanding αS/ΔNt-Tau.Tiada bintik-bintik yang berbeza dalam titisan sistem pLK dan Tau yang tidak cekap untuk gabungan/pembasahan.Untuk menguji sama ada kesan yang mengandungi αS dan Tau441 ini adalah agregat seperti amiloid, kami melakukan eksperimen serupa menggunakan mikroskop CF di mana Tau441 dilabelkan dengan Atto647N dan 12.5 μM amyloid-T (ThT) khusus amiloid telah ditambah dari awal.pewarna.Walaupun pewarnaan ThT bagi titisan atau rakit αS/Tau441 tidak diperhatikan walaupun selepas 24 jam pengeraman (Rajah 5b, titisan baris atas—baki titisan di atas rakit protein), struktur positif ThT yang mengandungi Atto647N-Tau441 di dalam rakit adalah sangat lemah.ini mereplikasi saiz, bentuk dan lokasi bintik-bintik yang diterangkan sebelumnya (Rajah 5b, baris tengah dan bawah), menunjukkan bahawa bintik-bintik itu mungkin sepadan dengan agregat seperti amiloid yang terbentuk dalam coacervates cecair penuaan.
WF 25 μM αS pada pelbagai masa pengeraman dan ketinggian fokus (z, jarak dari bawah tidak terikat) dengan kehadiran 25 μM Tau441 (1 μM AF488 berlabel αS dan Atto647N berlabel Tau441) dalam perigi plat mikroskop dengan penimbal LLPS) .Enam eksperimen diulang secara bebas dengan keputusan yang sama.b Imej mikroskopik CF 25 μM αS dengan kehadiran 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N berlabel Tau441) dan 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Titisan protein berwajaran dan rakit dan tompok protein termendap ditunjukkan di baris atas dan tengah, masing-masing.Baris bawah menunjukkan imej rakit dan titisan daripada 3 replika bebas.Anak panah putih menunjukkan titik-titik positif ThT dalam kedua-dua panel.Bar skala untuk semua imej ialah 20 µm.
Untuk mengkaji dengan lebih terperinci perubahan dalam rangkaian protein coacervate semasa peralihan daripada cecair kepada pepejal, kami menggunakan pengimejan seumur hidup pendarfluor (FLIM) dan mikroskop pemindahan tenaga resonans Förster (FRET) (Rajah 6 dan Rajah Tambahan 8 dan 9).Kami membuat hipotesis bahawa pematangan coacervate lapisan menjadi struktur protein terkumpul yang lebih pekat atau seperti pepejal membawa kepada sentuhan yang lebih rapat antara protein dan probe pendarfluor yang dilekatkan padanya, berpotensi menghasilkan kesan pelindapkejutan yang ditunjukkan dalam jangka hayat probe yang dipendekkan (τ) , seperti yang diterangkan sebelum ini40.,41,42.Selain itu, untuk sampel berlabel dua kali (AF488 dan Atto647N sebagai penderma FRET dan pewarna penerima, masing-masing), penurunan dalam τ ini juga boleh disertai dengan pemeluwapan coacervate dan peningkatan kecekapan FRET(E) semasa LSPT.Kami memantau pembentukan rakit dan tompok dari semasa ke semasa dalam sampel LLPS αS/Tau441 dan αS/ΔNt-Tau (25 µM setiap protein dalam penimbal LLPS yang mengandungi 1 µM AF488 berlabel αS dan/atau Atto647N berlabel Tau441 atau ΔNt-Tau).Kami memerhatikan trend umum bahawa jangka hayat pendarfluor probe AF488 (τ488) dan Atto647N (τ647N) berkurangan sedikit apabila coacervates matang (Rajah 6 dan Rajah Tambahan 8c).Menariknya, perubahan ini telah dipertingkatkan dengan ketara untuk titik dalam rakit (Rajah 6c), menunjukkan bahawa pemeluwapan protein selanjutnya berlaku pada titik.Untuk menyokong ini, tiada perubahan ketara dalam jangka hayat pendarfluor diperhatikan untuk titisan αS/ΔNt-Tau yang berumur selama 24 jam (Tambahan Rajah 8d), menunjukkan bahawa penggelapan titisan adalah proses yang berbeza daripada pengesanan dan yang tidak disertai dengan penyusunan semula molekul yang ketara. dalam coacervates.Perlu diingatkan bahawa titik-titik mempunyai saiz yang berbeza dan kandungan berubah dalam αS, terutamanya untuk sistem αS/Tau441 (Tambahan Rajah 8e).Pengurangan dalam jangka hayat pendarfluor tempat disertai dengan peningkatan keamatan, terutamanya untuk Atto647N berlabel Tau441 (Tambahan Rajah 8a), dan kecekapan FRET yang lebih tinggi untuk kedua-dua sistem αS/Tau441 dan αS/ΔNt-Tau, yang menunjukkan pemeluwapan selanjutnya dalam LLPS Lima jam selepas dicetuskan, protein di dalam elektrik statik terpeluwap.Berbanding dengan αS/ΔNt-Tau, kami memerhatikan nilai τ647N yang lebih rendah dan nilai τ488 yang agak lebih tinggi dalam bintik αS/Tau441, disertai dengan nilai FRET yang lebih rendah dan tidak homogen.Mungkin, ini mungkin berkaitan dengan fakta bahawa dalam sistem αS/Tau441, kelimpahan αS yang diperhatikan dan dijangka dalam agregat adalah lebih heterogen, selalunya substoikiometrik berbanding Tau, kerana Tau441 sendiri mungkin juga menjalani LLPS dan pengagregatan (Tambahan Rajah 8e) .Walau bagaimanapun, tahap penggabungan titisan, pembentukan rakit, dan, yang penting, pengagregatan protein dalam coacervates seperti cecair adalah maksimum apabila kedua-dua Tau441 dan αS hadir.
imej mikroskop pendarfluor seumur hidup (FLIM) αS/Tau441 dan αS/ΔNt-Tau pada 25 μM setiap protein (1 μM AF488 berlabel αS dan 1 μM Atto647N berlabel Tau441 atau ΔNt-Tau) dalam penimbal LLPS.Lajur menunjukkan imej perwakilan sampel LLPS pada masa pematangan yang berbeza (30 min, 5 jam dan 24 jam).Bingkai merah menunjukkan kawasan yang mengandungi tompok αS/Tau441.Jangka hayat ditunjukkan sebagai bar warna.Bar skala = 20 µm untuk semua imej.b Imej FLIM yang dizum masuk bagi kawasan yang dipilih, ditunjukkan dalam kotak merah dalam panel a.Julat hayat ditunjukkan menggunakan skala warna yang sama seperti dalam panel a.Bar skala = 5 µm.c Histogram menunjukkan AF488 (dilekatkan pada αS) atau Atto647N (dilekatkan pada Tau) untuk spesies protein yang berbeza (titisan-D-, rakit-R- dan speckle-P) yang dikenal pasti dalam imej FLIM yang direkodkan untuk αS-) taburan masa sepanjang hayat Tau441 dan Sampel coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI untuk D, 29-44 ROI untuk R dan 21-51 ROI untuk mata).Nilai min dan median ditunjukkan sebagai petak kuning dan garis hitam di dalam kotak, masing-masing.Sempadan bawah dan atas kotak masing-masing mewakili kuartil pertama dan ketiga, dan nilai minimum dan maksimum dalam julat antara kuartil (IQR) 1.5 kali ganda ditunjukkan sebagai misai.Outlier ditunjukkan sebagai berlian hitam.Kepentingan statistik antara pasangan taburan ditentukan menggunakan ujian-t dua sampel, dengan mengandaikan varians tidak sama.Nilai p ujian t dua hujung ditunjukkan dengan asterisk untuk setiap pasangan data yang dibandingkan (* nilai p > 0.01, ** nilai p > 0.001, *** nilai p > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns Menunjukkan keterbaikan (p-value > 0.05).Nilai p yang tepat diberikan dalam Jadual Tambahan 1, dan data asal dibentangkan sebagai fail data mentah.
Untuk menunjukkan lagi sifat bintik/agregat seperti amiloid, kami merawat sampel coacervate yang tidak ternoda selama 24 jam dengan kepekatan tinggi (1 M) NaCl, yang mengakibatkan pemisahan agregat daripada coacervates protein.Apabila agregat terpencil (iaitu, larutan agregat yang tersebar) diperhatikan menggunakan mikroskopi daya atom (AFM), kami memerhatikan morfologi yang kebanyakannya sfera dengan ketinggian biasa kira-kira 15 nm, yang cenderung untuk dikaitkan dalam keadaan kepekatan garam yang tinggi, sama dengan tingkah laku fibril amiloid biasa disebabkan oleh kesan hidrofobik yang kuat pada permukaan (perhatikan bahawa fibril biasanya mempunyai ketinggian ~ 10 nm) (Tambahan Rajah 10a).Menariknya, apabila agregat terpencil diinkubasi dengan ThT dalam ujian pendarfluor ThT standard, kami melihat peningkatan dramatik dalam hasil kuantum pendarfluor ThT, setanding dengan yang diperhatikan apabila pewarna diinkubasi dengan fibril amiloid αS tipikal (Tambahan Rajah 10b), menunjukkan bahawa agregat coacervate mengandungi struktur seperti amiloid..Malah, agregat bertolak ansur dengan kepekatan garam yang tinggi tetapi sensitif kepada 4 M guanidine klorida (GdnHCl), seperti fibril amiloid biasa (Tambahan Rajah 10c).
Seterusnya, kami menganalisis komposisi agregat menggunakan pendarfluor molekul tunggal, korelasi pendarfluor spesifik / spektroskopi korelasi silang (FCS / FCCS), dan analisis pecah pengesanan kebetulan dua warna (TCCD).Untuk tujuan ini, kami mengasingkan agregat yang terbentuk selepas 24 jam pengeraman dalam 100 μl sampel LLPS yang mengandungi αS dan Tau441 (kedua-duanya 25 μM) bersama dengan 1 μM AF488 berlabel αS dan 1 μM Atto647N berlabel Tau441.Cairkan larutan agregat terabur yang terhasil kepada keadaan monomolekul menggunakan penimbal bebas PEG yang sama dan 1 M NaCl (penampan yang sama digunakan untuk memisahkan agregat daripada coacervate) untuk mengelakkan sebarang kemungkinan interaksi elektrostatik antara LLPS dan protein.Contoh trajektori masa bagi molekul tunggal boleh dilihat dalam Rajah 7a.Analisis FCCS/FCS (korelasi silang, CC dan autokorelasi, AC) menunjukkan bahawa agregat yang mengandungi αS dan tau banyak terdapat dalam sampel (lihat lengkung CC dalam Rajah 7b, panel kiri), dan lebihan protein monomerik sisa timbul sebagai hasil daripada proses pencairan (lihat lengkung AC dalam Rajah 7b, panel kiri).Eksperimen kawalan yang dilakukan di bawah keadaan penyelesaian yang sama menggunakan sampel yang mengandungi hanya protein monomerik tidak menunjukkan lengkung CC, dan lengkung AC sesuai dengan model resapan satu komponen (Pers. 4), di mana protein monomerik mempunyai pekali resapan yang dijangkakan (Rajah 7b). ), panel kanan).Pekali resapan zarah terkumpul adalah kurang daripada 1 µm2/s, dan protein monomerik adalah kira-kira 1 µm2/s.50–100 µm/s;nilai adalah serupa dengan nilai yang diterbitkan sebelum ini untuk fibril amiloid αS tersonikasi dan αS monomerik secara berasingan di bawah keadaan penyelesaian yang serupa44.Apabila kami menganalisis agregat dengan analisis letupan TCCD (Rajah 7c, panel atas), kami mendapati bahawa dalam setiap agregat terpencil (αS/Tau heteroagregate), kira-kira 60% daripada agregat yang dikesan mengandungi kedua-dua αS dan tau, kira-kira 30% mengandungi hanya tau, kira-kira 10% αS sahaja.Analisis stoikiometrik bagi heteroagregat αS/Tau menunjukkan bahawa kebanyakan heteroagregat diperkaya dalam tau (stoikiometri di bawah 0.5, bilangan purata molekul tau setiap agregat adalah 4 kali lebih banyak daripada molekul αS), yang konsisten dengan kerja kami yang diperhatikan dalam FLIM in situ eksperimen..Analisis FRET menunjukkan bahawa agregat ini mengandungi kedua-dua protein, walaupun nilai FRET sebenar dalam kes ini tidak begitu penting, kerana pengedaran fluorofor dalam setiap agregat adalah rawak disebabkan oleh lebihan protein tidak berlabel yang digunakan dalam eksperimen.Menariknya, apabila kami melakukan analisis yang sama menggunakan 45, 46 varian Tau yang kekurangan pengagregatan amiloid matang (lihat Rajah Tambahan 11a, b), kami mendapati bahawa walaupun pengagregatan elektrostatik αS adalah sama (Tambahan Rajah 11c, d), keupayaan untuk membentuk agregat dalam coacervate telah berkurangan secara drastik dan FLIM mengesan beberapa tompok dalam eksperimen in situ, dan lengkung korelasi silang yang lemah diperhatikan untuk sampel agregat terpencil.Walau bagaimanapun, untuk sebilangan kecil agregat yang dikesan (hanya satu persepuluh daripada Tau441), kami mendapati bahawa setiap agregat diperkaya dalam αS daripada varian Tau ini, dengan kira-kira 50% daripada agregat yang dikesan hanya mengandungi molekul αS, dan αS adalah heterogen secara berlebihan. .agregat (lihat Rajah Tambahan 11e), berbeza dengan agregat heterogen yang dihasilkan oleh Tau441 (Rajah 6f).Keputusan eksperimen ini menunjukkan bahawa walaupun αS sendiri mampu terkumpul dengan tau dalam coacervate, nukleasi tau adalah lebih baik di bawah keadaan ini, dan agregat seperti amiloid yang terhasil mampu bertindak sebagai satu bentuk αS dan tau.Walau bagaimanapun, sebaik sahaja teras kaya tau terbentuk, interaksi heterotip antara αS dan tau diutamakan dalam agregat berbanding interaksi homotip antara molekul tau;kami juga memerhati rangkaian protein dalam cecair αS/tau coacervates.
a Representatif kesan temporal pendarfluor molekul tunggal agregat terpencil yang terbentuk dalam coacervates elektrostatik αS/Tau441.Letupan sepadan dengan koagregat αS/Tau441 (letupan di atas ambang yang dinyatakan) diperhatikan dalam tiga saluran pengesanan (pelepasan AF488 dan Atto647N selepas pengujaan langsung, garis biru dan merah, pelepasan Atto647N selepas pengujaan tidak langsung), FRET, garis ungu).b Analisis FCS/FCCS bagi sampel agregat αS/Tau441 terpencil yang diperoleh daripada LLPS (panel kiri).Lengkung autokorelasi (AC) untuk AF488 dan Atto647N ditunjukkan dalam warna biru dan merah, masing-masing, dan lengkung korelasi silang (CC) yang dikaitkan dengan agregat yang mengandungi kedua-dua pewarna ditunjukkan dalam warna ungu.Lengkung AC mencerminkan kehadiran spesies protein monomerik dan agregat berlabel, manakala lengkung CC hanya menunjukkan penyebaran agregat berlabel dua kali.Analisis yang sama, tetapi di bawah keadaan penyelesaian yang sama seperti di tempat terpencil, sampel yang mengandungi hanya monomerik αS dan Tau441 ditunjukkan sebagai kawalan dalam panel kanan.c Analisis kilat pendarfluor molekul tunggal agregat terpencil yang terbentuk dalam coacervates elektrostatik αS/Tau441.Maklumat untuk setiap agregat yang terdapat dalam empat ulangan berbeza (N = 152) diplotkan terhadap stoikiometri, nilai S dan kecekapan FRET (panel atas, bar warna mencerminkan kejadian).Tiga jenis agregat boleh dibezakan: -αS-sahaja agregat dengan S~1 dan FRET~0, Tau-sahaja agregat dengan S~0 dan FRET~1, dan heterogen Tau/αS agregat dengan perantaraan S dan FRET Anggaran jumlah kedua-dua protein penanda yang dikesan dalam setiap agregat heterogen (N = 100) ditunjukkan dalam panel bawah (skala warna mencerminkan kejadian).Data mentah disediakan dalam bentuk fail data mentah.
Kematangan atau penuaan protein cecair terkondensat menjadi struktur seperti gel atau pepejal dari semasa ke semasa telah dilaporkan terlibat dalam beberapa fungsi fisiologi kondensat47 serta dalam penyakit, sebagai proses yang tidak normal sebelum pengagregatan amiloid 7, 48, 49. Di sini kami mengkaji pemisahan fasa dan tingkah laku secara terperinci.LSPT αS dengan kehadiran polikasi rawak dalam persekitaran terkawal pada kepekatan mikromolar rendah dan keadaan fisiologi yang berkaitan (perhatikan bahawa kepekatan fisiologi αS yang dikira ialah> 1 µM50), mengikut tingkah laku biasa yang didorong secara termodinamik LPS.Kami mendapati bahawa αS, yang mengandungi kawasan terminal C bercas sangat negatif pada pH fisiologi, mampu membentuk titisan kaya protein dalam larutan akueus melalui LLPS dengan kehadiran peptida bercelaru yang sangat kationik seperti pLK atau Tau melalui proses elektrostatik. pemeluwapan kompleks dengan kehadiran makromolekul pengagregatan.Proses ini mungkin mempunyai kesan yang relevan dalam persekitaran selular di mana αS bertemu dengan pelbagai molekul polikasi yang dikaitkan dengan pengagregatan yang berkaitan dengan penyakitnya secara in vitro dan in vivo51,52,53,54.
Dalam banyak kajian, dinamik protein dalam titisan telah dianggap sebagai salah satu faktor utama yang menentukan proses pematangan55,56.Dalam elektrostatik αS coacervates dengan polikasi, proses pematangan nampaknya bergantung pada kekuatan interaksi dengan polikasi, valens, dan kepelbagaian interaksi ini.Teori keseimbangan mencadangkan bahawa landskap keseimbangan dua keadaan cecair ialah kehadiran titisan besar yang kaya dengan biopolimer yang memacu LLPS57,58.Pertumbuhan titisan boleh dicapai dengan kematangan Ostwald59, penyatuan60 atau penggunaan monomer bebas dalam fasa tersebar61.Untuk αS dan Tau441, ΔNt-Tau atau pLK, kebanyakan protein tertumpu dalam kondensat di bawah keadaan yang digunakan dalam kajian ini.Walau bagaimanapun, sementara titisan tau bersaiz penuh bercantum dengan cepat apabila membasahi permukaan, gabungan titisan dan pembasahan adalah sukar untuk ΔNt-Tau dan pLK, mencadangkan kehilangan sifat cecair yang cepat dalam kedua-dua sistem ini.Menurut analisis FLIM-FRET kami, titisan pLK dan ΔNt-Tau yang berumur menunjukkan tahap pengagregatan protein yang sama (seumur hidup pendarfluor yang serupa) sebagai titisan asal, menunjukkan bahawa rangkaian protein asal dikekalkan, walaupun lebih tegar.
Kami merasionalkan keputusan eksperimen kami dalam model berikut (Rajah 8).Titisan yang pada mulanya terbentuk secara sementara selalunya merupakan rangkaian protein tanpa pampasan elektrostatik, dan oleh itu terdapat kawasan ketidakseimbangan cas, terutamanya pada antara muka titisan, mengakibatkan titisan dengan potensi permukaan elektrostatik yang tinggi.Untuk mengimbangi cas (fenomena yang biasa dirujuk sebagai penyusutan valens) dan meminimumkan potensi permukaan titisan, titisan boleh memasukkan polipeptida baharu daripada fasa cair, menyusun semula rangkaian protein untuk mengoptimumkan interaksi cas-cas dan berinteraksi dengan titisan lain.dengan permukaan (pembasahan).Titisan αS/pLK, disebabkan rangkaian proteinnya yang lebih ringkas (hanya interaksi heterotip antara αS dan pLK) dan pertalian yang lebih besar untuk interaksi protein-protein, nampaknya dapat mengimbangi cas kondensat dengan lebih cepat;sesungguhnya, kami memerhatikan kinetik protein yang lebih pantas dalam coacervates αS/pLK yang terbentuk pada mulanya berbanding αS/Tau.Selepas penyusutan valens, interaksi menjadi kurang fana dan titisan kehilangan sifat cecairnya dan bertukar menjadi seperti gel, titisan tidak mudah terbakar dengan potensi permukaan elektrostatik yang rendah (dan oleh itu tidak dapat membasahi permukaan).Sebaliknya, titisan αS/Tau kurang cekap dalam mengoptimumkan keseimbangan cas titisan disebabkan oleh rangkaian protein yang lebih kompleks (dengan kedua-dua interaksi homotaip dan heterotipik) dan sifat interaksi protein yang lebih lemah.Ini menghasilkan titisan yang mengekalkan tingkah laku cecair untuk jangka masa yang panjang dan mempamerkan potensi permukaan elektrostatik tinggi yang cenderung diminimumkan dengan bercantum dan membesar (dengan itu meminimumkan nisbah luas permukaan/isipadu titisan) dan dengan membasahkan kimia permukaan hidrofilik.Ini mewujudkan perpustakaan protein pekat yang besar yang mengekalkan sifat bendalir kerana interaksi kekal sangat sementara disebabkan oleh carian berterusan untuk pengoptimuman caj dalam rangkaian protein.Menariknya, bentuk Tau yang dipangkas secara N-terminal, termasuk beberapa isoform62 yang berlaku secara semula jadi, mempamerkan tingkah laku pertengahan, dengan beberapa menyatukan penuaan dengan αS menjadi titisan seperti gel yang tahan lama, manakala yang lain berubah menjadi kondensat cecair besar.Dualiti dalam pematangan coacervates elektrostatik αS ini konsisten dengan kajian teori dan eksperimen LLPS baru-baru ini yang telah mengenal pasti korelasi antara penipisan valens dan penyaringan elektrostatik dalam kondensat sebagai kunci untuk mengawal saiz kondensat dan sifat bendalir.Mekanisme 58.61.
Skim ini menunjukkan laluan pengagregatan amiloid yang diduga untuk αS dan Tau441 melalui LLPS dan LSPT.Dengan kawasan tambahan yang kaya dengan anion (merah) dan kaya kation (biru), coacervates elektrostatik αS dan tau dengan valens yang memuaskan mempunyai tenaga permukaan yang lebih rendah dan oleh itu kurang penggabungan, mengakibatkan penuaan titisan yang cepat.Keadaan gel tidak beraglomerasi yang stabil dicapai..Keadaan ini sangat baik dalam kes sistem αS/pLK kerana pertalian yang lebih tinggi dan rangkaian interaksi pasangan protein yang lebih mudah, yang membolehkan peralihan seperti gel yang pantas.Sebaliknya, titisan dengan valensi yang tidak memuaskan dan, oleh itu, kawasan bercas protein yang tersedia untuk interaksi, menjadikannya lebih mudah bagi coacervate untuk melebur dan membasahi permukaan hidrofilik untuk mengurangkan tenaga permukaannya yang tinggi.Keadaan ini lebih baik untuk coacervates αS/Tau441, yang mempunyai rangkaian kompleks multivalen yang terdiri daripada interaksi Tau-Tau dan αS-Tau yang lemah.Sebaliknya, coacervates yang lebih besar akan lebih mudah mengekalkan sifat seperti bendalir mereka, membolehkan interaksi protein-ke-protein lain berlaku.Akhirnya, agregat heterogen amiloid yang mengandungi kedua-dua αS dan tau terbentuk dalam cecair coacervate, yang mungkin berkaitan dengan yang terdapat dalam badan inklusi, yang merupakan ciri penyakit neurodegeneratif.
Struktur besar seperti bendalir yang terbentuk semasa pematangan αS/Tau441 dengan persekitaran protein yang sangat sesak tetapi dinamik dan, pada tahap yang lebih rendah, coacervates αS/ΔNt-Tau adalah takungan yang sesuai untuk penukleasian pengagregatan protein.Kami sememangnya telah memerhatikan pembentukan agregat protein pepejal dalam jenis coacervates protein ini, selalunya mengandungi kedua-dua αS dan tau.Kami telah menunjukkan bahawa heteroagregat ini distabilkan oleh interaksi bukan elektrostatik, dapat mengikat pewarna ThT khusus amiloid dengan cara yang sama seperti fibril amiloid biasa, dan sememangnya mempunyai rintangan yang sama terhadap pelbagai pengaruh.Agregat αS/tau yang dibentuk oleh LLPS ditunjukkan mempunyai sifat seperti amiloid.Sesungguhnya, varian matang Tau yang kekurangan dalam pengagregatan amiloid adalah terjejas dengan ketara dalam pembentukan agregat αS heterogen ini dalam coacervate elektrostatik cecair.Pembentukan agregat αS/Tau441 hanya diperhatikan di dalam coacervates, yang mengekalkan sifat seperti cecair, dan tidak pernah, jika coacervates/titisan tidak mencapai keadaan gel.Dalam kes kedua, peningkatan kekuatan interaksi elektrostatik dan, akibatnya, ketegaran rangkaian protein menghalang penyusunan semula konformasi yang diperlukan bagi protein untuk mewujudkan interaksi protein baharu yang diperlukan untuk nukleasi amiloid.Walau bagaimanapun, ini boleh dicapai dalam coacervates seperti cecair yang lebih fleksibel, yang seterusnya berkemungkinan kekal cair apabila saiznya bertambah.
Hakikat bahawa pembentukan agregat dalam fasa pekat adalah lebih baik dalam pemeluwapan αS/Tau besar daripada dalam titisan kecil yang cepat gel, menyerlahkan perkaitan mengenal pasti faktor yang mengawal penyatuan titisan.Oleh itu, bukan sahaja terdapat kecenderungan untuk pemisahan fasa, tetapi saiz kondensat mesti dikawal untuk berfungsi dengan betul serta pencegahan penyakit58,61.Keputusan kami juga menyerlahkan kepentingan keseimbangan antara LLPS dan LSPT untuk sistem αS/Tau.Walaupun pembentukan titisan boleh melindungi daripada pengagregatan amiloid dengan mengurangkan jumlah monomer protein yang tersedia di bawah keadaan tepu, seperti yang telah dicadangkan dalam sistem lain63, 64, pelakuran titisan pada tahap titisan tinggi boleh membawa kepada pengagregatan protein dalaman melalui penyusunan semula konformasi yang perlahan.rangkaian protein..
Secara keseluruhan, data kami sangat menekankan perkaitan valens kohesif dan interaksi yang berpuas hati/tidak berpuas hati dalam rangkaian drop dalam konteks LSPT.Khususnya, kami menunjukkan bahawa kondensat αS/Tau441 panjang penuh dapat menyatu dan nukleus dengan cekap untuk membentuk heteroagregat seperti amiloid yang merangkumi kedua-dua protein dan mencadangkan mekanisme molekul berdasarkan keputusan eksperimen kami.Pengagregatan bersama dua protein dalam cecair αS/Tau menyatukan yang kami laporkan di sini mungkin berkaitan dengan penyetempatan bersama dua protein dalam kemasukan, yang merupakan ciri penyakit, dan mungkin menyumbang kepada pemahaman hubungan antara LLPS dan pengagregatan amiloid, membuka jalan bagi IDP bercas tinggi dalam neurodegenerasi.
Monomeric WT-αS, mutan sistein (Q24C-αS, N122C-αS) dan varian ΔCt-αS (Δ101-140) dinyatakan dalam E. coli dan disucikan seperti yang diterangkan sebelum ini.5 mM DTT dimasukkan dalam semua langkah dalam penulenan mutan sistein αS untuk mencegah pembentukan ikatan disulfida.Isoform Tau441 (plasmid diperoleh daripada Addgene #16316), varian ΔNt-Tau (Δ1–150, diperoleh dengan mengklon IVA dengan primer CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) dan varian AggDef-Tau dengan primer kultur EGC1, 3GTC5 yang dimurnikan (1ΔTC5-Tau). berkembang kepada OD600 = 0.6-0.7 pada 37 ° C dan 180 rpm, dan ekspresi diinduksi dengan IPTG selama 3 jam pada 37 ° C.Tuai sel pada 11,500 xg selama 15 minit pada 4 °C dan basuh dengan penimbal garam yang mengandungi 150 mM NaCl.Gantung semula pelet dalam penimbal lisis (20 ml setiap 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100).Langkah sonication dilakukan di atas ais dengan amplitud 80% untuk 10 denyutan (1 min on, 1 min off).Jangan melebihi 60 ml dalam satu ultrasound.E. coli lysates dipanaskan pada 95° C. selama 20 minit, kemudian disejukkan di atas ais dan disentrifugasi pada 127,000×g selama 40 minit.Supernatan yang telah dijelaskan telah digunakan pada membran 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) dan dialisis terhadap 4 L penimbal dialisis (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0.1 mM) selama 10 jam.Lajur pertukaran kation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) telah diseimbangkan dengan penimbal keseimbangan (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) .Tau lysate ditapis melalui penapis PVDF 0.22 μm dan disuntik ke dalam lajur pada kadar aliran 1 ml/min.Elusi dijalankan secara beransur-ansur, tau telah dielusi dengan penimbal elusi 15–30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Pecahan dianalisis oleh SDS-PAGE, dan mana-mana pecahan yang mengandungi satu jalur dengan jangkaan berat molekul tau telah ditumpukan menggunakan penapis emparan 10 kDa dan digantikan dengan penimbal yang mengandungi 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM dan DTT 2 mM untuk kepekatan protein akhir ialah 100 μM.Larutan protein kemudiannya disalurkan melalui penapis PVDF 0.22 μm, dengan cepat dibekukan dan disimpan pada -80°C.Protein K18 telah disediakan oleh Prof. Alberto Boffi.Ketulenan penyediaan adalah >95% seperti yang disahkan oleh SDS-PAGE dan MALDI-TOF/TOF.Pelbagai sistein dilabel secara kimia dengan AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat) atau TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).telah disahkan oleh penyerapan dan MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau dan K18 dilabelkan dengan sisa sistein asli pada kedudukan 191 dan 322 menggunakan Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Jerman) mengikut prosedur yang sama.Caj bersih setiap peta sisa untuk αS dan Tau441 dijana menggunakan CIDER66.
Poli-L-lisin pepejal (pLK DP 90-110 mengikut NMR daripada pembekal, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, Amerika Syarikat) telah dilarutkan dalam 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 hingga 10 mM kepekatan, proses sonicated selama 5 minit dalam mandi air ultrasonik dan simpan pada -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) dan FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) adalah larut air dan diedarkan secara meluas dalam penimbal LLPS.Dialisis membuang garam yang mencemarkan.Mereka kemudiannya ditapis melalui penapis picagari dengan saiz liang 0.22 μm, dan kepekatannya dikira menggunakan refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, Amerika Syarikat).Sampel LLPS disediakan pada suhu bilik dalam susunan berikut: penimbal dan penyemperitan dicampur dan 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etana- 1, 2-diyldinitrile) asid tetraacetic (EDTA, carboxynth) dan campuran 1% perencat protease (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Kemudian αS dan polikasi bercantum (pilihan pLK atau Tau) ditambah.Untuk eksperimen siri masa thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), gunakan jumlah kepekatan ThT menjadi separuh daripada kepekatan αS.Campurkan sampel dengan lembut tetapi teliti untuk memastikan ia homogen.Kepekatan setiap komponen berbeza dari percubaan ke percubaan, seperti yang diterangkan dalam bahagian Keputusan.Azide digunakan pada kepekatan 0.02% (b/v) apabila tempoh eksperimen melebihi 4 jam.Untuk semua analisis menggunakan sampel LLPS, benarkan campuran untuk mengimbangi selama 5 minit sebelum analisis.Untuk analisis serakan cahaya, 150 µl sampel telah dimuatkan pada plat mikro 96-telaga yang tidak mengikat (µClear®, hitam, Telaga F-Bottom/Chimney, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) dan ditutup dengan filem pelekat.LLP dipantau dengan mengukur penyerapan pada 350 nm di tengah penyelesaian dalam pembaca plat CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Jerman).Eksperimen telah dijalankan dalam tiga kali ganda pada 25°C, dan ralat dikira sebagai sisihan piawai daripada min.Fasa cair dikira dengan sentrifugasi sampel dan analisis gel SDS-PAGE, dan pecahan αS dalam fasa cair dan pekat dikira dalam pelbagai penyelesaian LLPS.Sampel LLPS 100 μl yang mengandungi αS berlabel AF488 1 μM telah disediakan dengan pencampuran menyeluruh diikuti dengan sentrifugasi pada 9600×g selama 30 minit, selepas itu mendakan biasanya kelihatan.50 μl atas supernatan digunakan untuk pengiraan protein menggunakan gel SDS-PAGE.Gel telah diimbas dengan penapis AF488 menggunakan sistem pengimejan gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) atau diwarnai dengan pewarnaan Coomassie dan divisualisasikan dengan penapis yang sesuai.Band yang terhasil dianalisis menggunakan ImageJ versi 1.53i (National Institutes of Health, USA).Eksperimen telah dijalankan secara pendua dalam dua eksperimen berbeza dengan keputusan yang sama.
Biasanya, 150 μl sampel digunakan pada plat mikro 96-telaga yang tidak mengikat dan divisualisasikan pada suhu bilik pada mikroskop terbalik Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman).Untuk eksperimen tempat, plat µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman) atau plat mikro polistirena 96-telaga (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) juga digunakan.EL6000 halogen atau lampu halida logam merkuri digunakan sebagai sumber pencahayaan (masing-masing untuk pengimejan BF/DIC dan WF).Untuk mikroskopi WF, objektif udara pembesaran 40x (Leica Microsystems, Jerman) digunakan untuk memfokuskan cahaya pada sampel dan mengumpulnya.Untuk sampel berlabel AF488 dan ThT, penapis pengujaan dan pelepasan dengan set penapis GFP standard, pengujaan dan penapis laluan jalur pelepasan, masing-masing, penapis laluan jalur 460–500 nm dan 512–542 nm, dan cermin dichroic 495 nm.Untuk sampel yang dilabelkan dengan Atto647N, set standard penapis Cy5 dengan penapis jalur pengujaan dan pelepasan 628-40 nm dan 692-40 nm, dan cermin dichroic 660 nm digunakan.Untuk mikroskopi BF dan DIC, gunakan objektif pengumpulan cahaya pantulan yang sama.Cahaya yang dikumpul telah dirakam pada kamera CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Jerman).Masa pendedahan ialah 50 ms untuk pengimejan mikroskopi BF dan DIC dan 20-100 ms untuk pengimejan mikroskopi WF.Sebagai perbandingan, masa pendedahan untuk semua eksperimen dengan ThT ialah 100 ms.Eksperimen selang masa telah dilakukan untuk menggambarkan gabungan titisan, dengan imej dikumpulkan setiap 100 ms selama beberapa minit.ImageJ (NIH, USA) digunakan untuk analisis imej.Eksperimen telah dijalankan dalam tiga kali ganda dengan keputusan yang sama.
Untuk eksperimen kolokalisasi, pembinaan semula FRAP dan 3D, imej telah diperoleh pada mikroskop konfokal terbalik Zeiss LSM 880 menggunakan edisi biru ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jerman).Sampel 50 µl telah digunakan pada hidangan Petri µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Jerman), dirawat dengan polimer hidrofilik (ibiTreat) dan dipasang dalam objektif rendaman minyak 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) pada DIC).Imej diperoleh menggunakan garisan laser argon 458 nm, 488 nm, dan 633 nm dengan resolusi 0.26 µm/piksel dan masa pendedahan 8 µs/piksel untuk tetingkap pengujaan dan pengesanan pelepasan 470–600 nm, 493–628 nm, dan 638-755 nm digunakan untuk memvisualisasikan ThT, AF488 dan Atto647N, masing-masing.Untuk eksperimen FRAP, fotografi selang masa bagi setiap sampel direkodkan pada 1 bingkai sesaat.Eksperimen telah dijalankan dalam tiga kali ganda pada suhu bilik dengan keputusan yang sama.Semua imej dianalisis menggunakan perisian edisi biru Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jerman).Lengkung FRAP telah dinormalisasi, diplot dan dipasang pada data intensiti/masa yang diekstrak daripada imej menggunakan Zen 2 menggunakan OriginPro 9.1.Lengkung pemulihan telah dipasang pada model mono-eksponen untuk mengambil kira resapan molekul dengan istilah eksponen tambahan untuk mengambil kira kesan pelunturan pemerolehan.Kami kemudian mengira D menggunakan jejari pelunturan nominal dan separuh hayat pemulihan yang ditentukan sebelumnya seperti dalam persamaan Kang et al.5 35 ditunjukkan.
Varian sistein tunggal αS telah disintesis dengan 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) pada kedudukan 24 (TEMPOL-24-αS) dan 122 (TEMPOL-122-αS), masing-masing.Pelabelan Putaran Untuk eksperimen EPR, kepekatan αS ditetapkan pada 100 μM dan kepekatan PEG ialah 15% (w/v).Untuk pelbagai keadaan pengagregatan, nisbah αS:pLK ialah 1:10, manakala nisbah αS:ΔNt-Tau dan αS:Tau441 dikekalkan pada 1:1.Untuk eksperimen titrasi mengikat tanpa adanya kesesakan, TEMPOL-122-αS dikekalkan pada 50 μM dan polikasi telah dititrasi pada peningkatan kepekatan, menyediakan setiap keadaan secara berasingan.Pengukuran CW-EPR telah dijalankan menggunakan spektrometer jalur X Bruker ELEXSYS E580 yang dilengkapi dengan resonator Bruker ER4118 SPT-N1 yang beroperasi pada frekuensi gelombang mikro (SHF) ~9.7 GHz.Suhu ditetapkan pada 25°C dan dikawal oleh kriostat nitrogen cecair.Spektrum diperoleh dalam keadaan tak tepu pada kuasa MW 4 mW, amplitud modulasi 0.1 mT, dan frekuensi modulasi 100 kHz.Keamatan spektrum telah dinormalisasi untuk mengelakkan perbezaan dalam kepekatan putaran antara sampel dan kemungkinan pengurangan putaran disebabkan oleh kepekatan sisa agen pengurangan dalam sampel yang mengandungi Tau441 atau ΔNt-Tau (hadir dalam larutan protein asal).Nilai g yang diberikan diperolehi hasil daripada pemodelan spektrum EPR yang dilakukan menggunakan perisian Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) yang dilaksanakan dalam Matlab®67.Satu/dua model isotropik komponen telah digunakan untuk memodelkan data.Selepas menormalkan semua isyarat, baki dikira dengan menolak setiap simulasi daripada spektrum eksperimen yang sepadan.Untuk analisis pentitratan mengikat, keamatan relatif jalur ketiga kepada jalur kedua spektrum EPR ternormal (IIII/III) digunakan untuk memantau pengikatan polikasi kepada αS.Untuk menganggarkan pemalar pemisahan (Kd), lengkung yang terhasil telah dipasang pada model anggaran dengan mengandaikan n tapak pengikatan yang sama dan bebas.
Eksperimen spektroskopi NMR telah dijalankan menggunakan spektrometer NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) yang dilengkapi dengan cryoprobe dan Z-gradient.Semua eksperimen dilakukan menggunakan 130–207 µM αS dan αS/ΔNt-Tau dan pLK yang sepadan dalam 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 dan dilakukan pada 15°C.Untuk memantau LPS oleh NMR, 10% PEG telah ditambah kepada sampel pra-campuran.Plot gangguan anjakan kimia (Rajah 1b) menunjukkan purata anjakan kimia 1H dan 15N.Spektrum αS 2D1H-15N HSQC telah ditetapkan berdasarkan tugasan sebelumnya (masukan BMRB #25227) dan disahkan dengan merekod dan menganalisis spektrum 3D HNCA, HNCO dan CBCAcoNH.Anjakan kimia 13Cα dan 13Cβ dikira dengan kehadiran ΔNt-Tau atau pLK untuk mengukur kemungkinan perubahan dalam trend struktur sekunder berbanding dengan anjakan kimia αS dalam konformasi gegelung rawak tulen 68 (Tambahan Rajah 5c).Kadar R1ρ diukur dengan merekodkan eksperimen hsqctretf3gpsi (diperolehi daripada perpustakaan Bruker) dengan kelewatan 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, dan 800 ms, dan fungsi eksponen telah diselaraskan kepada kelewatan intensiti puncak yang berbeza kali untuk menentukan R1ρ dan ketidakpastian eksperimennya.
Eksperimen mikroskopi pendarfluor penyelesaian masa dua warna telah dilakukan pada mikroskop confocal pendarfluor MT200 penyelesaian masa komersial (PicoQuant, Berlin, Jerman) dengan peranti pengiraan foton tunggal (TCSPC) berkorelasi masa.Kepala diod laser digunakan untuk pengujaan interleaved berdenyut (PIE), rasuk melalui pandu gelombang mod tunggal dan ditala kepada kuasa laser 10 hingga 100 nW untuk garisan laser 481 nm dan 637 nm diukur selepas cermin dichroic.Ini memastikan kadar pengiraan foton yang optimum, mengelakkan kesan pengalian foton, pelunturan foto dan tepu.Slip atau plat μ-angiogenesis slaid (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman) diletakkan terus dalam air rendaman di atas kanta Super Apochromat 60x NA 1.2 dengan kolar pembetulan (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Cermin dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) digunakan sebagai pemisah rasuk utama.Sinaran tidak fokus disekat oleh lubang dengan diameter 50 mikron, kemudian sinaran fokus dibahagikan kepada 2 laluan pengesanan oleh pembahagi rasuk 50/50.Penapis pelepasan jalur jalur (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 untuk pewarna hijau (AF488) dan 690/70 untuk pewarna merah (Atto647N) telah digunakan di hadapan pengesan.Diod avalanche foton tunggal (SPAD) (Peranti Foton Mikro, Bolzano, Itali) digunakan sebagai pengesan.Kedua-dua pengumpulan dan analisis data dilakukan menggunakan perisian SymphoTime64 yang tersedia secara komersial (PicoQuant GmbH, Berlin, Jerman).
Lima puluh mikroliter sampel LLPS telah digunakan pada telaga angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman).Imej yang terhasil difokuskan pada 20 µm di atas dasar telaga untuk jarak kerja objektif optimum untuk titisan terampai dan kepada ~1 µm untuk rakit dan titik dengan resolusi paksi sekurang-kurangnya 0.25 µm/piksel dan masa tunda 400 µs/piksel.Pilih data dengan menggunakan ambang keamatan berdasarkan purata keamatan isyarat latar belakang (PBG, min + 2σ) untuk setiap saluran supaya hanya titisan protein cecair, rakit atau tompok dipilih, menapis sebarang kemungkinan asal daripada fasa tersebar.Untuk menganalisis jangka hayat setiap spesies (τ) setiap saluran (hijau, "g" untuk AF488 dan merah, "r" untuk Atto647N), kami memilih kawasan menarik (ROI) yang mengandungi titisan, rakit atau bintik (Tambahan Rajah 1). ).8b) dan memperolehnya dengan memasangkan pereputan seumur hidup mereka (τD, τR dan τP untuk titisan, rakit atau tompok, masing-masing, lihat Rajah Tambahan 8c) dalam setiap saluran menggunakan analisis muat ekor dan model pereputan dua komponen.Purata τ daripada τ .ROI yang menghasilkan terlalu sedikit foton untuk muat berbilang eksponen telah dikecualikan daripada analisis.Potongan yang digunakan ialah <104 foton untuk rakit dan titik dan 103 untuk titisan.Titisan mempunyai ambang yang lebih rendah kerana sukar untuk mendapatkan lengkung pereputan dengan nilai keamatan yang lebih tinggi, kerana titisan dalam medan imej biasanya lebih kecil dan kurang banyak.ROI dengan kiraan foton melebihi had pengumpulan foton (ditetapkan kepada >500 kiraan/piksel) turut dibuang untuk analisis.Padankan keluk pereputan intensiti yang diperolehi dari kawasan yang diminati dengan intensiti pada 90% daripada maksimum (sedikit selepas keamatan pereputan maksimum) dari permulaan hayat perkhidmatan untuk memastikan gangguan IRF yang minimum sambil mengekalkan keamatan yang sama untuk semua pereputan intensiti tetapan Tetingkap masa relatif Telah dianalisis 25 hingga 50 ROI untuk rakit dan tompok dan 15-25 ROI untuk titisan, imej yang dipilih daripada lebih daripada 4 ulangan direkodkan daripada sekurang-kurangnya 3 eksperimen bebas.Ujian-t dua ekor telah digunakan untuk menilai perbezaan statistik antara spesies atau antara sistem coacervate.Untuk analisis piksel demi piksel sepanjang hayat (τ), jumlah pengecilan sepanjang hayat di atas medan untuk setiap saluran telah dikira dan anggaran model pengecilan eksponen 2/3 komponen telah dijalankan.Pengecilan seumur hidup untuk setiap piksel kemudiannya dipasang menggunakan nilai τ yang dikira sebelum ini, menghasilkan imej muat FLIM pseudocolor.Julat seumur hidup muat ekor adalah sama merentas semua imej saluran yang sama, dan setiap pereputan menghasilkan foton yang mencukupi untuk memberikan kesesuaian yang boleh dipercayai.Untuk analisis FRET, piksel telah dipilih dengan menggunakan ambang keamatan yang lebih rendah sebanyak 100 foton, yang purata isyarat latar belakang (FBG) sebanyak 11 foton.Keamatan pendarfluor setiap saluran telah diperbetulkan oleh faktor pembetulan yang ditentukan secara eksperimen: 69 crosstalk spektrum α ialah 0.004, pengujaan langsung β ialah 0.0305, kecekapan pengesanan γ ialah 0.517.Kecekapan FRET pada tahap piksel kemudiannya dikira menggunakan persamaan berikut:
di mana FDD ialah keamatan pendarfluor yang diperhatikan dalam saluran penderma (hijau), FDA ialah keamatan pendarfluor yang diperhatikan dalam saluran penerima (merah) di bawah pengujaan tidak langsung, dan FAA ialah keamatan pendarfluor yang diperhatikan dalam saluran penerima (merah) di bawah pengujaan langsung ( PIE).Denyutan keamatan pendarfluor diperhatikan dalam saluran).
Letakkan 100 µl larutan tindak balas LLPS yang mengandungi 25 µM monomerik tidak berlabel Tau441 (dengan atau tanpa 25 µM αS) dalam penimbal LLPS (ditambah seperti di atas) pada plat mikro 96-telaga yang tidak mengikat dengan salutan kerajang pelekat dan pembentukan titisan disemak oleh mikro WF. keseimbangan.dalam masa 10 min.Selepas 48 jam pengeraman pada suhu bilik, kehadiran rakit dan bintik-bintik protein telah disahkan.Kemudian keluarkan dengan teliti cecair di atas rakit dari telaga, kemudian tambahkan 50 L penimbal pemisahan (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) dan eramkan selama 10 minit.Kepekatan garam yang tinggi memastikan bahawa LLPS tidak akan berulang disebabkan oleh baki PEG, dan kemungkinan pemasangan protein yang terbentuk hanya melalui interaksi elektrostatik akan dibongkar.Bahagian bawah telaga kemudian dikikis dengan berhati-hati dengan hujung mikropipet dan larutan yang terhasil dipindahkan ke telaga pemerhatian kosong.Selepas pengeraman sampel dengan 50 μM ThT selama 1 jam, kehadiran bintik-bintik terpencil telah diperiksa oleh mikroskop WF.Sediakan gentian αS tersonikasi dengan mengeram 300 µl larutan 70-µM αS dalam PBS dengan pH 7.4, natrium azida 0.01% pada 37 °C dan 200 rpm pada penggoncang orbit selama 7 hari.Penyelesaian itu kemudiannya disentrifugasi pada 9600×g selama 30 minit, pelet digantung semula dalam PBS pH 7.4 dan sonikasi (1 min, kitaran 50%, amplitud 80% dalam sonikator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) sampel fibril. dengan taburan saiz gentian kecil yang agak seragam.
Analisis FCS/FCCS dan pengesanan kebetulan dua warna (TCCD) dilakukan pada mikroskop confocal fluoresen MT200 yang sama (Pico-Quant, Berlin, Jerman) yang digunakan untuk eksperimen mikroskop FLIM-FRET menggunakan mod PIE.Kuasa laser untuk eksperimen ini telah ditambah kepada 6.0 µW (481 nm) dan 6.2 µW (637 nm).Gabungan kuasa laser ini dipilih untuk menghasilkan kecerahan yang serupa untuk pasangan fluorofor yang digunakan sambil mencapai kadar kiraan optimum dan mengelakkan pelunturan foto dan tepu.Kedua-dua pengumpulan dan analisis data dilakukan menggunakan perisian SymphoTime64 versi 2.3 yang tersedia secara komersial (PicoQuant, Berlin, Jerman).
Sampel agregat αS/Tau terpencil yang diperoleh menggunakan LLPS dicairkan dalam penimbal pengasingan kepada kepekatan monomolekul yang sesuai (biasanya pencairan 1:500, kerana agregat sudah berada pada kepekatan rendah apabila diasingkan daripada sampel coacervate).Sampel telah digunakan terus pada penutup (Corning, USA) yang disalut dengan larutan BSA pada kepekatan 1 mg/mL.
Untuk analisis PIE-smFRET dalam saluran hijau dan merah, ambang keamatan yang lebih rendah sebanyak 25 foton digunakan untuk menapis isyarat intensiti rendah yang disebabkan oleh peristiwa monomerik (perhatikan bahawa monomer melebihi jumlah sampel agregat berbanding dengan agregat terpencil).Ambang ini dikira sebagai lima kali ganda purata keamatan monomer αS yang diperoleh daripada analisis sampel monomer tulen untuk memilih agregat secara khusus untuk dianalisis.Litar pemacu PIE, bersama-sama dengan pemerolehan data TSCPC, telah membolehkan penggunaan penapis pemberat seumur hidup yang membantu menghilangkan latar belakang dan crosstalk spektrum.Keamatan nyalaan yang dipilih menggunakan ambang di atas telah diperbetulkan menggunakan isyarat latar belakang purata yang ditentukan daripada histogram kejadian berbanding keamatan/tong sampah sampel penimbal sahaja.Ledakan yang dikaitkan dengan agregat besar biasanya menduduki beberapa tong berturut-turut dalam surih masa (ditetapkan kepada 1 ms).Dalam kes ini, tong dengan kekuatan maksimum telah dipilih.Untuk analisis FRET dan stoikiometrik, faktor gamma γ (0.517) yang ditentukan secara teori telah digunakan.Sumbangan silang spektrum dan pengujaan langsung boleh diabaikan (ditentukan secara eksperimen) pada kuasa laser pengujaan yang digunakan.Kecekapan dan stoikiometri FRET dalam letupan dikira seperti berikut.