ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tiub Dikimpal Dupleks Untuk Komponen kimia Industri Kimia, Kekurangan SPECC1L membawa kepada peningkatan kestabilan sendi yang disambung dan pengurangan penumpahan sel puncak saraf kranial.

Terima kasih kerana melawat Nature.com.Anda menggunakan versi penyemak imbas dengan sokongan CSS terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami menunjukkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tiub Dikimpal Dupleks Untuk Industri Kimia

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ialah pengeluar terkemuka yang mengkhusus dalam paip lancar keluli tahan karat , tiub anil terang , tiub bergelung lancar dsb .Untuk memudahkan pelanggan, kami juga mempunyai paip dan tiub yang dikimpal.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.mempunyai peralatan pengeluaran dan pengujian yang paling maju.Kami benar-benar boleh memenuhi keperluan anda.Mengikut piawaian yang sangat ketat, tiub yang dihasilkan oleh kami sentiasa mempunyai toleransi OD dan WT yang betul.Kawalan toleransi adalah mengikut ketat untuk menghasilkan piawaian.Produk kami sentiasa berpuas hati dengan pelanggan .Pelanggan yang membeli produk kami mencipta lebih banyak keuntungan.
a) OD ( Diameter Luar ) : 3.18mm hingga 101.6mm
b) WT ( Ketebalan Dinding ) : 0.5mm hingga 20mm
c) Panjang: Mengikut keperluan pelanggan
d) Piawaian : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 dsb
e) Kaedah Proses : ERW, EFW dll

Peluncur menunjukkan tiga artikel setiap slaid.Gunakan butang belakang dan seterusnya untuk bergerak melalui slaid, atau butang pengawal slaid di hujung untuk bergerak melalui setiap slaid.
Sel puncak saraf kranial (CNCC) mengelupas lipatan saraf embrio dan berhijrah ke lengkung faring, yang membentuk sebahagian besar struktur muka tengah.Disfungsi CNCC memainkan peranan penting dalam etiologi celah orofasial, kecacatan kongenital yang biasa.Mutasi SPECC1L heterozigot telah dijumpai pada pesakit dengan celah atipikal dan sindromik.Di sini, kami melaporkan pewarnaan yang dipertingkatkan bagi komponen simpang pelekat kanonik (AJ), β-catenin dan E-cadherin dalam sel knockdown SPECC1L berbudaya, dan mikrograf elektron menunjukkan penyebaran apikal-basal AJ.Untuk memahami peranan SPECC1L dalam morfogenesis kraniofasial, kami mencipta model tetikus kekurangan Specc1l.Mutan homozigot adalah embrio yang membawa maut dan mempamerkan penutupan tiub neural terjejas dan laminasi CNCC.Pewarnaan protein AJ meningkat dalam lipatan saraf mutan.Kecacatan AJ ini adalah konsisten dengan kecacatan dalam delaminasi CNCC, yang memerlukan pembubaran AJ.Di samping itu, mutan Specc11 telah mengurangkan isyarat PI3K-AKT dan meningkatkan apoptosis.In vitro, perencatan ringan isyarat PI3K-AKT dalam sel jenis liar adalah mencukupi untuk mendorong perubahan AJ.Yang penting, perubahan AJ yang disebabkan oleh knockdown SPECC1L boleh diterbalikkan dengan pengaktifan laluan PI3K-AKT.Diambil bersama, data ini mencadangkan bahawa SPECC1L, sebagai pengawal selia baru bagi isyarat PI3K-AKT dan biologi AJ, diperlukan untuk penutupan tiub neural dan stratifikasi CNCC.
Sel-sel puncak neural kranial (CNCCs) menyetempat ke neuroectoderm dorsal dan terlepas daripada neuroepitelium lipatan saraf yang sedang berkembang melalui proses yang melibatkan peralihan epitelium-mesenchymal (EMT)1,2,3.CNCC epitelium prahijrah mengganggu persimpangan antara sel dan menjadi CNCC mesenchymal yang berhijrah yang mengisi gerbang faring pertama dan kedua dan membentuk sebahagian besar rawan kraniofasial.Oleh itu, gen yang mengawal fungsi CNCC sering terganggu dalam etiologi anomali kongenital kraniofasial seperti celah orofasial, yang paling biasa menjejaskan 1/800 kelahiran di AS sahaja.Salah satu kecacatan kongenital8.
Delaminasi CNCC bertepatan dengan penutupan tiub saraf anterior antara 8.5 dan 9.5 hari perkembangan embrio pada tikus.Mutan beberapa gen yang berkaitan dengan celah orofasial tikus juga menunjukkan beberapa bentuk kecacatan tiub saraf, termasuk Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, dan Pdgfrα12.Walau bagaimanapun, proses penutupan tiub neural dan stratifikasi CNCC boleh dianggap bebas, kerana tetikus mutan Splotch (Pax3) mempamerkan kecacatan dalam penutupan tiub neural tanpa sebarang kesan ke atas stratifikasi atau migrasi CNCC 13,14.Model tetikus tambahan dengan kecacatan dalam pembedahan CNCC dan penutupan tiub saraf akan membantu menggambarkan asas molekul biasa bagi kedua-dua proses ini.
Pengasingan CNCC daripada sel neuroepithelial memerlukan pembubaran persimpangan pelekat (AJs), yang terdiri daripada kompleks protein yang mengandungi, antara lain, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, dan α-actinin yang dikaitkan dengan filamen aktin 2 Kajian overexpression E-cadherin dalam lipatan saraf menunjukkan pengurangan atau kelewatan dalam delaminasi CNCC.Sebaliknya, penindasan E-cadherin menghasilkan stratifikasi awal15,16.Banyak faktor yang menjadi pengantara EMT semasa stratifikasi CNCC ialah faktor transkripsi (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) dan protein pengubahsuaian matriks ekstraselular (ECM) seperti matriks metalloproteinase (MMP), namun CNCC adalah pengawal selia AJ sitoskeletal langsung. belum diketahui.Laluan PI3K-AKT diketahui menentang tahap E-cadherin, terutamanya daripada penyelidikan kanser17.Kajian terbaru menunjukkan bahawa kehilangan isyarat PI3K-AKT berasaskan PDGFα pada tikus membawa kepada keabnormalan kraniofasial, termasuk lelangit sumbing dan kecacatan tiub saraf12.Walau bagaimanapun, hubungan antara laluan PI3K-AKT dan kestabilan AJ pada stratifikasi CNCC tidak jelas.
Kami sebelum ini mengenal pasti SPECC1L sebagai gen mutan pertama dalam dua orang dengan celah teruk yang menjangkau dari mulut ke mata, yang dikenali sebagai celah serong (ObFC) atau celah Tessier IV18.Mutasi SPECC1L telah dikenal pasti dalam dua keluarga multigenerasi dengan sindrom Opitz G/BBB yang dominan autosomal (OMIM #145410), di mana individu yang terjejas mempamerkan hyperdistance dan celah bibir/lelangit19, dan dalam satu keluarga dengan sindrom jarak jauh Tibi (OMIM #145420)20 .lebih separuh daripada kes sindrom Opitz G/BBB adalah berkaitan X (OMIM #300000) dan disebabkan oleh mutasi dalam gen MID1, yang mengekod protein 22 rangka sel yang berkaitan dengan mikrotubulus.Kami membuat hipotesis bahawa SPECC1L, juga protein yang dikaitkan dengan mikrotubul dan sitoskeleton aktin, boleh menjadi pengantara isyarat yang diperlukan untuk pembentukan semula sitoskeleton aktin semasa lekatan dan penghijrahan sel 18 .Melalui kajian in vitro dan in vivo, kami kini menggambarkan SPECC1L sebagai pengawal selia baru kestabilan AJ melalui isyarat PI3K-AKT.Pada peringkat selular, kekurangan SPECC1L mengakibatkan penurunan dalam tahap protein pan-AKT dan peningkatan dalam penyebaran apikal-basal AJ, yang telah dihapuskan oleh pengaktifan kimia laluan AKT.In vivo, embrio kekurangan Specc11 menunjukkan penutupan tiub saraf terjejas dan pemotongan CNCC yang berkurangan.Oleh itu, SPECC1L berfungsi dalam isyarat berasaskan lekatan sel yang sangat terkawal yang diperlukan untuk fungsi CNCC biasa semasa morfogenesis muka.
Untuk mencirikan peranan SPECC1L pada peringkat selular, kami menggunakan garis sel osteosarcoma stabil U2OS yang diterangkan sebelumnya dalam SPECC1L18.Sel U2OS yang stabil dengan ketukan SPECC1L (kd) ini mempunyai penurunan sederhana (60-70%) dalam tahap transkrip dan protein SPECC1L, bersama-sama dengan kecacatan dalam penghijrahan dan penyusunan semula sitoskeleton aktin 18. Sebaliknya, penurunan sementara yang teruk dalam SPECC1L telah ditunjukkan membawa kepada kecacatan mitosis 23 .Selepas pencirian lanjut, kami mendapati bahawa sel SPECC1L-kd kami yang stabil mengubah morfologi pada tahap pertemuan yang sangat tinggi (Rajah 1).Sel kawalan individu dan sel kd pada pertemuan rendah kelihatan serupa (Rajah 1A, D).24 jam selepas pelakuran, sel kawalan mengekalkan bentuk kuboidnya (Rajah 1B, E), manakala sel SPECC1L-kd memanjang (Rajah 1C, F).Tahap perubahan dalam bentuk sel ini telah ditangkap oleh pengimejan langsung in vivo sel kawalan dan sel kd (filem 1).Untuk menentukan peranan SPECC1L dalam sel konfluen, kami mula-mula memeriksa ekspresinya.Kami mendapati bahawa tahap protein SPECC1L meningkat apabila gabungan (Rajah 1G), manakala tahap transkrip SPECC1L tidak meningkat (Rajah 1H).Di samping itu, apabila ketumpatan sel meningkat, protein SPECC1L terkumpul di sempadan antara sel (Rajah 2A-E), dengan corak bertindih dengan β-catenin yang berkaitan dengan membran (Rajah 2A'-E').Memandangkan persatuan SPECC1L dengan sitoskeleton aktin 18, 23 kami membuat hipotesis bahawa SPECC1L berinteraksi dengan persimpangan pelekat berasaskan aktin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) sel memanjang pada pertemuan tinggi (F) berbanding mengawal sel U2OS (AC).Ditunjukkan di sini ialah tiga daripada enam titik masa (T1, T3, T6) yang kami pilih untuk ketumpatan sel yang berbeza.(G) Analisis Western blot menunjukkan bahawa protein SPECC1L distabilkan pada tahap pertemuan yang tinggi berbanding dengan tahap pertemuan yang rendah dalam sel kawalan.Western blot SPECC1L menunjukkan jalur 120 kDa yang dijangkakan dan jalur berat molekul yang lebih tinggi, mungkin diubah suai selepas translasi (*).Analisis Western blot dilakukan di bawah keadaan yang sama untuk pertemuan rendah dan tinggi.Imej yang menunjukkan SPECC1L pada pertemuan rendah dan tinggi telah diambil dari bintik yang sama.Blot yang sama telah dikeluarkan dan diperiksa semula dengan antibodi β-aktin.(H) Analisis RT-PCR kuantitatif menunjukkan tiada perubahan ketara dalam tahap transkrip SPECC1L.Bar ralat mewakili SEM daripada empat eksperimen bebas.
(AE) Kami memilih enam titik masa (T1-T6) yang mewakili julat ketumpatan sel untuk menormalkan analisis bentuk sel dan perubahan AJ dalam sel U2OS dengan SPECC1L knockdown (kd).Lima titik masa pertama ini termasuk sel tunggal (T1), 50-70% gabungan gugusan sel kecil (T2), gabungan tanpa membentuk semula sel kd (T3), membentuk semula sel kd (T4), dan perubahan 24 jam.dalam bentuk posterior sel kd (T5).Protein SPECC1L kebanyakannya tersebar dalam sitoplasma pada T1 (A), tetapi pengumpulannya diperhatikan pada sempadan antara sel pada titik masa berikutnya (B-E, anak panah).(FJ) β-catenin menunjukkan pengumpulan yang sama pada sempadan antara sel yang dikaitkan dengan kompleks AJ.(A'-E') SPECC1L dan β-catenin menunjukkan pewarnaan bertindih pada sempadan sel pada ketumpatan sel tinggi (anak panah).(F'-J') Dalam sel SPECC1L-kd, pewarnaan β-catenin kelihatan normal pada ketumpatan sel rendah (F'-H'), tetapi mengembang apabila bentuk sel berubah (I', J'; anak panah), menunjukkan bahawa AJ telah berubah.Bar = 10 µm.
Kami kemudian cuba menentukan kesan kekurangan SPECC1L pada AJ.Kami menggunakan beberapa penanda yang berkaitan dengan AJ, termasuk komponen kanonik F-actin, myosin IIb, β-catenin, dan E-cadherin24,25,26,27.Gentian tegasan aktin meningkat dalam sel SPECC1L-kd seperti yang diterangkan sebelum ini (Rajah 3A, B) 18 .Myosin IIb yang dikaitkan dengan filamen aktin menunjukkan peningkatan yang sama dalam sel SPECC1L-kd secara in vitro (Rajah 3C, D).β-catenin yang berkaitan dengan AJ mengikat kadherin pada membran sel, menunjukkan corak ekspresi "sarang lebah" biasa dalam kubosit kawalan (Rajah 3E, G).Menariknya, dalam imej rata yang menggunakan mikroskop confocal, pewarnaan β-catenin (Rajah 3E, F) dan E-cadherin (Rajah 3G,H) pada membran sel sel kekurangan SPECC1L konfluen menunjukkan corak pewarnaan lanjutan yang menonjol.Pengembangan pewarnaan β-catenin yang berkaitan dengan AJ dalam sel kd ini paling ketara pada pertemuan, tetapi nampaknya mendahului perubahan dalam bentuk sel (Rajah 2F-J, F'-J').Untuk menentukan sifat fizikal pewarnaan AJ yang dilanjutkan ini, kami memeriksa sempadan sel pada permukaan apikal-basal sel SPECC1L-kd U2OS dengan mikroskop elektron penghantaran (TEM) (Rajah 3I, J).Berbeza dengan sel kawalan (Rajah 3I), yang mempunyai kawasan padat elektron berasingan yang menunjukkan AJ (anak panah), sel kd (Rajah 3J) menunjukkan kawasan yang besar dan bersebelahan dengan ketumpatan elektron tinggi yang menunjukkan AJ di sepanjang satah apicobasal..Di samping itu, pada bahagian melintang, kami memerhatikan lipatan membran sel yang meluas dalam sel kd (Rajah S1A, B), yang menerangkan corak lanjutan jalur pewarnaan β-catenin dan E-cadherin (Rajah 3F, H).Untuk menyokong peranan SPECC1L dalam AJs, β-catenin telah diimunopresipitasi bersama dengan SPECC1L dalam lisat sel U2OS konfluen (Rajah 3K).Bersama dengan imunostaining lanjutan untuk penanda AJ, analisis TEM adalah konsisten dengan hipotesis kami bahawa kekurangan SPECC1L meningkatkan ketumpatan dan varians apikal-basal AJ.
(AH) Peningkatan pewarnaan F-aktin dalam sel kd pada 48 jam selepas gabungan (T6; A, B).Pewarnaan myosin IIb yang diubah yang dikaitkan dengan F-actin (C, D).Corak licin pewarnaan membran β-catenin dan E-cadherin dalam sel kawalan (E, G) telah dipertingkatkan dalam sel SPECC1L-kd (F, H).Bar = 10 µm.(I-J) Mikrograf elektron memerhatikan persimpangan antara sel apikal-basal.Sel kawalan menunjukkan kawasan padat elektron yang berbeza yang menunjukkan persimpangan melekit (I, anak panah).Sebaliknya, keseluruhan persimpangan apikal-basal dalam sel SPECC1L-kd kelihatan padat elektron (J, anak panah), menunjukkan peningkatan ketumpatan dan penyebaran persimpangan pelekat.( K ) β-catenin telah diimunopresipitasi bersama dengan SPECC1L dalam lisat sel U2OS yang konfluen.Imej diambil dari satu tempat yang mewakili satu daripada empat eksperimen bebas.
Untuk memahami peranan SPECC1L dalam morfogenesis kraniofasial, kami mencipta model tetikus kekurangan Specc1l menggunakan dua garisan sel perangkap ES bebas, DTM096 dan RRH048 (BayGenomics, CA), yang mewakili transkrip intron 1 dan Specc1l telah ditangkap pada 15 (Rajah 1) .4A, rajah S2).Lokasi genom sisipan vektor umpan ditentukan oleh penjujukan genom keseluruhan dan disahkan oleh PCR (Rajah S2).Kedua-dua reka bentuk perangkap gen juga membenarkan gabungan dalam bingkai wartawan Specc11-lacZ apabila ditangkap.Oleh itu, ungkapan lacZ yang ditentukan oleh pewarnaan X-gal digunakan sebagai penunjuk ekspresi Specc11.Kedua-dua alel menunjukkan corak ekspresi lacZ yang sama, dengan perangkap gen DTM096 dalam intron 1 menunjukkan ekspresi yang lebih kuat daripada RRH048 dalam intron 15 (tidak ditunjukkan).Walau bagaimanapun, Specc1l dinyatakan secara meluas, dengan ekspresi yang sangat kuat dalam lipatan saraf pada E8.5 (Rajah 4B), dalam tiub saraf dan proses muka pada E9.5 dan E10.5 (Rajah 4C, D), dan dalam membangunkan anggota badan di E10.5 dan mata (Rajah 4D).Kami sebelum ini melaporkan bahawa ekspresi SPECC1L dalam gerbang pharyngeal pertama di E10.5 hadir dalam epitelium dan mesenchyme18 yang mendasari, selaras dengan garis keturunan CNCC.Untuk menguji ekspresi SPECC1L dalam CNCC, kami melakukan lipatan saraf E8.5 (Rajah 4E-J) dan bahagian tengkorak E9.5 (Rajah 4K-).Pada E8.5, SPECC1L mewarnai lipatan saraf dengan kuat (Rajah 4E, H), termasuk sel yang diwarnai dengan penanda NCC (Rajah 4G, J).Pada E9.5, SPECC1L (Rajah 4K, N) ternoda kuat CNCC penghijrahan yang diwarnakan bersama AP2A (Rajah 4L, M) atau SOX10 (Rajah 4O, P).
(A) Perwakilan skematik gen Specc11 tetikus yang menunjukkan penyisipan vektor umpan dalam klon sel ES DTM096 (intron 1) dan RRH048 (intron 15).(BD) pewarnaan lacZ bagi embrio Specc1lDTM096 heterozigot yang mewakili ekspresi Specc1l dari E8.5 hingga E10.5.NE = neuroectoderm, NF = lipatan saraf, PA1 = gerbang pharyngeal pertama.(EP) SPECC1L imunostaining dengan penanda NCC AP2A dan SOX10 dalam lipatan saraf E8.5 (NF; EJ) dan bahagian tengkorak E9.5 (KP).Pewarnaan SPECC1L diperhatikan secara meluas dalam lipatan saraf E8.5 (E, H; anak panah), termasuk sel yang dilabelkan dengan AP2A (F, G; anak panah) dan SOX10 (I, J; anak panah).Pada E9.5, SPECC1L mewarna dengan kuat CNCC (K, N; anak panah) berlabel AP2A (L, M; anak panah) dan SOX10 (O, P; anak panah).
Persilangan antara tikus Specc1lDTM096/+ dan Specc1lRRH048/+ heterozigot menunjukkan bahawa kedua-dua alel perangkap gen tidak saling melengkapi dan heterozigot sebatian dan homozigot embrio untuk kedua-dua alel perangkap gen adalah membawa maut embrio (Jadual S1).Nisbah Mendelian menunjukkan penurunan dalam kadar survival heterozigot semasa lahir (dijangka 1.34 berbanding 2.0).Kami mencatatkan kematian perinatal yang rendah di kalangan heterozigot, ada yang mempunyai anomali kraniofasial (Rajah S3).Walau bagaimanapun, penembusan rendah fenotip kraniofasial perinatal ini menjadikannya sukar untuk mengkaji mekanisme patofisiologi asasnya.Oleh itu, kami memberi tumpuan kepada fenotip maut embrio mutan Specc11 homozigot.
Kebanyakan embrio mutan Specc1lDTM096/RRH048 kompaun heterozigot atau homozigot tidak berkembang selepas E9.5–10.5 (Rajah 5A–D), dan tiub neural tidak ditutup di hadapan (Rajah 5B, D) dan kadangkala ditutup di belakang (tidak ditunjukkan) ..Kecacatan penutupan tiub neural kranial ini dikaitkan dengan majoriti CNCC bertanda DLX2 yang tinggal dalam lipatan saraf pada E10.5, menunjukkan tiada pembedahan (Rajah 5A'-D').Untuk menentukan sama ada saiz keseluruhan CNCC juga dikurangkan, kami menandakan garis CNCC dengan GFP dalam talian perangkap gen kami dengan Wnt1-Cre dan ROSAmTmG.Kami menstrimkan GFP+ NCC dan GFP- (RFP+) bukan NCC daripada keseluruhan embrio.Pada E9.5, perkadaran CNCC berlabel GFP yang diisih aliran tidak berubah dengan ketara antara WT dan embrio mutan (tidak ditunjukkan), menunjukkan spesifikasi CNCC biasa.Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa sisa pewarnaan Wnt1-Cre dan DLX2 dalam lipatan saraf terdedah (Rajah 5B') adalah disebabkan oleh lapisan CNCC yang rosak, mungkin disebabkan oleh peningkatan ketumpatan atau penyebaran sel AJ, seperti yang dilihat dalam sel SPECC1L-kd.Kami menggunakan penanda NCC SOX10, AP2A, dan DLX2 untuk mengesahkan kehadiran CNCC dalam lipatan saraf (Rajah 5E-R).Pada E8.5, pewarnaan lipatan saraf untuk ketiga-tiga penanda NCC diperhatikan dalam bahagian WT (Rajah 5E, G, I) dan mutan Specc1l (Rajah 5F, H, J).Pada E9.5, manakala penanda NCC mengotorkan NCC yang berpindah dalam bahagian WT (Rajah 5M, O, Q), sisa pewarnaan NCC diperhatikan dalam lipatan saraf terdedah bagi embrio mutan Specc1l (Rajah 5N, P, R).Oleh kerana SOX10 dan DLX2 menandakan CNCC yang berhijrah, keputusan ini menunjukkan bahawa CNCC yang kekurangan SPECC1L mencapai spesifikasi selepas migrasi tetapi gagal berhijrah dari lipatan saraf.
Kekurangan Specc11 membawa kepada penutupan tiub neural yang rosak, delaminasi sel puncak neural kranial dan AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrio yang membawa sel-sel puncak saraf kranial (CNCC) yang berhijrah dilabelkan dengan Wnt1-Cre (A').Sebaliknya, embrio mutan Specc11 menunjukkan lipatan saraf terbuka (B), kepala anak panah) dan CNCC yang belum berhijrah (B', anak panah).(C, D') Imej medan terang (C, D') dan imunostaining (C', D') penanda CNCC DLX2 bagi embrio E10.5 WT (C, C') dan Specc1l (D, D').Dalam embrio WT E10.5, CNCC positif DLX2 menjajah gerbang insang (C', anak panah), manakala dalam mutan, pewarnaan yang ketara berterusan dalam lipatan saraf terbuka (D', anak panah) dan dalam lengkung pharyngeal pertama (D', anak panah).) dengan beberapa pewarnaan (anak panah) yang menunjukkan delaminasi dan penghijrahan CNCC yang lemah.ER) Bahagian embrio mutan WT dan Specc1l pada peringkat E8.5 (E–L) dan E9.5 (M–R) telah dilabelkan dengan penanda NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) dan DLX2 (I, J, Q, R).Pada E8.5, pewarnaan NCC diperhatikan dalam lipatan saraf jenis liar (NF) dan bahagian mutan.Pewarnaan bersama SOX10 dan β-catenin dalam E8.5 WT (K) dan mutan (L) mendedahkan peningkatan pewarnaan β-catenin pada sempadan sel dalam lipatan saraf.Pada E9.5, pewarnaan jenis liar CNCC yang berpindah (M, O, Q) diperhatikan, manakala dalam mutan, CNCC yang tidak berstrata mengotorkan lipatan saraf terbuka (N, P, R).(S–Z) Analisis pelabelan in vivo AJ dalam bahagian koronal embrio WT dan Specc11DTM096/RRH048 dengan mutasi E9.5.Anggaran satah keratan ditunjukkan di sudut kanan atas.Dalam bahagian tisu mutan, peningkatan pewarnaan F-actin (S, T) dan myosin IIb (U, V) diperhatikan.Sama seperti keputusan in vitro dalam Rajah 3, dalam embrio mutan, pewarnaan membran yang dipertingkatkan untuk β-catenin (W, X) dan E-cadherin (Y, Z) telah diperhatikan.(AA-BB) Mikrograf elektron bagi bahagian embrio jenis liar yang melihat melepasi sempadan sel apikal-basal menunjukkan kawasan padat elektron yang berbeza menunjukkan persimpangan pelekat (AA, anak panah).Sebaliknya, dalam bahagian embrio mutan Specc11 (BB, anak panah), keseluruhan persimpangan apicobasal adalah padat elektron, menunjukkan peningkatan ketumpatan dan penyebaran persimpangan pelekat.
Untuk menguji hipotesis kami bahawa lapisan berkurangan adalah disebabkan oleh AJ yang diubah, kami memeriksa pelabelan AJ dalam lipatan saraf terdedah bagi embrio mutan Specc1l (Rajah 5S-Z).Kami memerhatikan peningkatan gentian tegasan aktin (Rajah 5S, T) dan peningkatan penyetempatan myosin IIB yang serentak pada gentian aktin (Rajah 5U, V).Yang penting, kami memerhatikan peningkatan pewarnaan β-catenin (Rajah 5W, X) dan E-cadherin (Rajah 5Y, Z) pada sempadan antara sel.Kami juga memeriksa pewarnaan β-catenin NCC dalam lipatan saraf embrio E8.5 (Rajah 5K, L).Pewarnaan β-catenin kelihatan lebih kuat dalam lipatan saraf mutan Specc1l (Rajah 5L dan K), menunjukkan bahawa perubahan AJ telah bermula.Dalam mikrograf elektron bahagian tengkorak embrio E9.5, kami sekali lagi memerhatikan peningkatan pewarnaan padat elektron meresap dalam embrio mutan Specc1l berbanding WT (Rajah 5AA, BB dan S1E-H).Secara keseluruhan, keputusan ini menyokong keputusan in vitro kami dalam sel SPECC1L-kd U2OS dan mencadangkan bahawa pewarnaan AJ yang menyimpang mendahului stratifikasi CNCC dalam embrio mutan kami.
Memandangkan hubungan antagonis yang diketahui antara aktiviti AKT dan kestabilan E-cadherin, 17,28 kami membuat hipotesis penglibatan isyarat PI3K-AKT.Di samping itu, kami memerhatikan lepuh subepidermis dalam beberapa embrio mutan kami yang terlepas daripada kematian (<5%) pada E9.5-10.5 dan sebaliknya menetap di sekitar E13.5 (Rajah S3).Vesikel subepidermal adalah ciri isyarat PI3K-AKT yang dikurangkan berdasarkan PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) melaporkan bahawa gangguan pengaktifan PI3K berasaskan PDGFRα dalam embrio mutan PdgfraPI3K/PI3K mengakibatkan vesikel subepidermal, kecacatan tiub neural dan fenotip lelangit sumbing.Sesungguhnya, tahap pan-AKT dan Ser473-AKT terfosforilasi aktif telah dikurangkan secara in vivo dalam tisu mutan Specc1l kepada penangkapan embrio E9.5 (Rajah 6A-D).Penurunan tahap Ser473-AKT terfosforilasi mungkin sepenuhnya disebabkan oleh penurunan tahap pan-AKT in vivo (Rajah 6E) dan in vitro (Rajah 6F).Penurunan in vitro diperhatikan hanya apabila sel U2OS sangat bercampur dengan perubahan dalam bentuk sel dan ketumpatan AJ (Rajah 6D).Oleh itu, data kami mencadangkan bahawa SPECC1L adalah pengawal selia positif baru bagi isyarat PI3K-AKT dalam morfogenesis kraniofasial.
(A–E) E8.5 (A,B) dan E9.5 (C,D) bahagian tengkorak atau lisat E9.5 daripada embrio mutan Specc1l (E) yang menunjukkan tahap pengurangan fosforilasi aktif S473-AKT dan pan-AKT Protein , berbanding dengan kawalan WT.Western blotting dilakukan pada lisat jenis liar dan lisat mutan di bawah keadaan yang sama.Imej-imej yang ditunjukkan untuk SPECC1L telah diambil dari satu titik.Blot yang sama telah dikeluarkan dan diperiksa semula dengan antibodi anti-pan-ACT dan β-actin.Tahap Pan-AKT dalam lipatan saraf E8.5 (A, B) dan tahap S473-AKT terfosforilasi dalam bahagian tengkorak E9.5 telah berkurangan dengan ketara.(F) Tahap Pan-AKT juga dikurangkan dalam lisat sel SPECC1L-kd U2OS yang dituai pada pertemuan tinggi.Bar ralat mewakili SEM daripada tiga kuantifikasi tompok Barat bebas.(GJ) Bahagian embrio WT pada E9.5 yang diwarnakan dengan KI67 dan caspase 3 yang dibelah, masing-masing menunjukkan percambahan sel (G, G ') dan sedikit aktiviti apoptosis (H, H ').Embrio mutan Specc11 menunjukkan percambahan sel yang setanding (I), tetapi bilangan sel yang menjalani apoptosis meningkat dengan ketara (J).
Kami kemudian memeriksa penanda percambahan dan apoptosis.Kami tidak melihat sebarang perbezaan dalam percambahan embrio E9.5 (Rajah 6E, G berbanding dengan I) dengan indeks percambahan 82.5% untuk mutan WT dan 86.5% untuk mutan Specc1l yang diukur dengan pewarnaan KI67 (p <0.56, Fisher's ujian tepat).Begitu juga, kami tidak melihat sebarang perbezaan dalam apoptosis yang diukur dengan pewarnaan untuk caspase 3 yang dibelah dalam lipatan saraf pada E8.5 sehingga penangkapan embrio (tidak ditunjukkan) (tidak ditunjukkan).Sebaliknya, apoptosis meningkat dengan ketara dalam semua embrio mutan E9.5 (Rajah 6F, H dan J).Peningkatan keseluruhan dalam apoptosis ini konsisten dengan isyarat PI3K-AKT yang dikurangkan dan kematian embrio awal29,30,31.
Seterusnya, untuk mengesahkan peranan kausal bagi isyarat PI3K-AKT dalam perubahan AJ dalam sel kd kami, kami secara kimia mengubah laluan dalam kawalan dan sel kd (Rajah 7A-F).Kami menggunakan sebagai penanda fenotip perubahan bentuk sel yang diperhatikan dalam sel SPECC1L-kd konfluen, yang kami ukur menggunakan nisbah dimensi terpanjang (panjang) kepada dimensi menegak (lebar) yang sepadan.Nisbah 1 dijangka untuk sel yang agak bulat atau kuboid (Rajah 7G).Sebagai tambahan kepada bentuk sel, kami juga mengesahkan kesan pada AJ dengan pewarnaan β-catenin (Rajah 7A'-F').Perencatan laluan PI3K-AKT menggunakan wortmannin adalah mencukupi untuk menukar bentuk sel dalam sel kawalan (Rajah 7A, C) dan AJ (Rajah 7A ').Pengaktif PI3K-AKT SC-79 tidak menjejaskan bentuk sel (Rajah 7A, E) atau pengembangan AJ (Rajah 7A') dalam sel kawalan.Dalam sel SPECC1L-kd, penindasan selanjutnya laluan PI3K-AKT mengakibatkan peningkatan apoptosis (Rajah 7B, D) dan peningkatan ketara dalam pewarnaan β-catenin (Rajah 7B'), selaras dengan mutan berat in vivo kami.Yang penting, pengaktifan laluan PI3K-AKT telah meningkatkan bentuk sel dengan ketara (Rajah 7B, F) dan fenotip AJ (Rajah 7B").Perubahan dalam bentuk sel dikira sebagai nisbah kebulatan sel (CCR) dan dibandingkan untuk kepentingan seperti yang diterangkan di atas (Rajah 7G).Sesungguhnya, dalam sel kawalan (Rajah 7G, CCR = 1.56), rawatan wortmannin adalah mencukupi untuk mengubah bentuk sel dengan ketara (Rajah 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) setakat yang serupa dengan yang diperhatikan. dalam SPECC1L.sel -kd (Rajah 7G, CCR = 3.46).Rawatan Wortmannin bagi sel SPECC1L-kd (Rajah 7G, CCR = 3.60, boleh diabaikan) tidak lebih ketara daripada sel kd yang tidak dirawat (Rajah 7G, CCR = 3.46, boleh diabaikan) atau sel kawalan yang dirawat wortmannin (Rajah 7G)., CCR = 3.46, boleh diabaikan) juga menjejaskan pemanjangan sel (7G, CCR = 3.61, boleh diabaikan).Paling penting, pengaktif SC-79 AKT memulihkan fenotip memanjang sel SPECC1L-kd (Rajah 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Keputusan ini mengesahkan bahawa SPECC1L mengawal isyarat PI3K-AKT dan mencadangkan bahawa penurunan sederhana dalam SPECC1L menjejaskan lekatan sel, manakala penurunan yang kuat membawa kepada apoptosis (Rajah 8).
Kawalan (A–F') (A, C, E) dan sel SPECC1L-kd (B, D, F) dirawat dengan Rawatan wortmannin (C, D) atau pengaktif SC-79 (E, F) perencat laluan PI3K-AKT .Sel kawalan yang tidak dirawat adalah kuboid (A) dengan pewarnaan selular β-kucing biasa (A'), manakala sel kd memanjang (B) dengan pewarnaan β-kucing yang meningkat (B').Selepas penindasan laluan PI3K-AKT, sel kawalan memanjang (C) dengan pengembangan β-cat (C'), manakala sel kd mula menjalani apoptosis (D), serupa dengan embrio kami yang sangat bermutasi dan menunjukkan β-kucing yang sangat dipertingkatkan.pewarnaan (D').Selepas pengaktifan laluan PI3K-AKT, sel kawalan kekal kuboid (E) dan mempunyai pewarnaan β-cat (E') biasa, manakala sel kd menunjukkan pewarnaan bentuk sel (F) dan β-cat (F') yang bertambah baik dengan ketara, menunjukkan (G) Tahap perubahan bentuk sel dalam (AF) dikira menggunakan nisbah kebulatan sel (CCR) bagi dimensi (panjang) terpanjang dan dimensi menegak (lebar) yang sepadan menggunakan perisian MetaMorph.Sel SPECC1L-kd yang tidak dirawat (NT) (CCR = 3.46) jauh lebih lama daripada sel kawalan (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13).Perencatan Wort terhadap laluan PI3K-AKT dalam sel kawalan adalah mencukupi untuk menyebabkan pemanjangan yang sama dalam bentuk sel (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Begitu juga, pengaktifan AKT oleh SC-79 dalam sel SPECC1L-kd memulihkan pemanjangan sel untuk mengawal tahap (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Rawatan Wortmannin bagi sel SPECC1L-kd mengakibatkan peningkatan apoptosis tetapi tiada peningkatan lagi dalam perubahan bentuk sel (CCR=3.60) berbanding dengan kd yang tidak dirawat (CCR=3.46, ns) atau sel kawalan yang dirawat wortmannin (3.61) yang diperhatikan dalam .ns = tidak penting.+/- Pengukuran SEM untuk 50 sel ditunjukkan.Perbezaan statistik dikira menggunakan ujian-t Pelajar.
(A) Perwakilan skematik perencatan dan pengaktifan laluan PI3K-AKT yang mengakibatkan perubahan dan penyelamatan AJ, masing-masing.(B) Model yang dicadangkan untuk penstabilan protein AKT oleh SPECC1L.
CNCC premigratori memerlukan lisis AJ untuk memisahkan daripada sel neuroepithelial lipatan saraf anterior1,15,32.Peningkatan pewarnaan komponen AJ dan kehilangan taburan asimetri AJ apikal-basal dalam sel kekurangan SPECC1L kedua-dua in vitro dan in vivo, digabungkan dengan kedekatan fizikal SPECC1L kepada β-catenin, mencadangkan bahawa SPECC1L berfungsi untuk mengekalkan kestabilan tempatan AJ dengan betul untuk otot organisasi.sitoskeleton aktin.Perkaitan SPECC1L dengan sitoskeleton aktin dan β-catenin dan peningkatan bilangan filamen aktin pekat jika tiada SPECC1L adalah konsisten dengan peningkatan yang diperhatikan dalam ketumpatan AJ.Kemungkinan lain ialah peningkatan bilangan gentian aktin dalam sel kekurangan SPECC1L membawa kepada perubahan dalam ketegangan antara sel.Oleh kerana tegasan selular menjejaskan dinamik AJ 33, perubahan voltan boleh menyebabkan AJ 34 lebih meresap.Jadi sebarang perubahan akan menjejaskan lapisan CNCC.
Wnt1 dinyatakan dalam lipatan saraf awal yang menimbulkan sel puncak saraf.Oleh itu, pengesanan keturunan Wnt1-cre menandakan NCC35 sebelum dan berhijrah.Walau bagaimanapun, Wnt1 juga menandakan klon tisu otak dorsal yang juga berasal daripada lipatan saraf awal 35,36 , menjadikan kemungkinan pewarnaan mutan E9.5 kami untuk penanda Wnt1 dalam lipatan saraf terbuka bukan CNCC.Pewarnaan positif kami untuk penanda NCC AP2A dan SOX10 mengesahkan bahawa lipatan saraf terdedah bagi embrio mutan Specc11 sememangnya mengandungi CNCC.Di samping itu, memandangkan AP2A dan SOX10 adalah penanda NCC penghijrahan awal, pewarnaan positif menunjukkan bahawa sel-sel ini adalah CNCC selepas migrasi yang tidak boleh distratakan oleh E9.5.
Data kami mencadangkan bahawa peraturan molekul AJ oleh SPECC1L dimediasi oleh isyarat PI3K-AKT.Isyarat AKT dikurangkan dalam sel dan tisu kekurangan SPECC1L.Penemuan oleh Fantauzzo et al.menyokong peranan langsung untuk isyarat PI3K-AKT dalam morfogenesis kraniofasial.(2014) menunjukkan bahawa kekurangan pengaktifan isyarat PI3K-AKT berasaskan PDGFRα membawa kepada fenotip lelangit sumbing.Kami juga menunjukkan bahawa perencatan laluan PI3K-AKT adalah mencukupi untuk menukar bentuk AJ dan sel dalam sel U2OS.Selaras dengan penemuan kami, Cain et al.37 menunjukkan bahawa downregulation subunit PI3K α110 dalam sel endothelial menghasilkan peningkatan yang sama dalam pewarnaan β-catenin perisel, yang dirujuk sebagai peningkatan dalam "indeks sambungan".Walau bagaimanapun, dalam sel endothelial yang filamen aktinnya sudah sangat teratur, penindasan laluan PI3K-AKT menghasilkan bentuk sel yang longgar.Sebaliknya, sel SPECC1L-kd U2OS menunjukkan bentuk sel yang memanjang.Perbezaan ini mungkin khusus jenis sel.Walaupun penindasan isyarat PI3K-AKT secara kekal menjejaskan sitoskeleton aktin, kesan pada bentuk sel ditentukan oleh perubahan dalam ketegangan yang disebabkan oleh perubahan dalam ketumpatan dan organisasi gentian aktin pusat.Dalam sel U2OS, kami hanya menggunakan perubahan bentuk sel sebagai penanda perubahan dan pemulihan AJ yang kekurangan SPECC1L.Sebagai kesimpulan, kami membuat hipotesis bahawa perencatan laluan AKT dalam kekurangan SPECC1L meningkatkan kestabilan AJ dan mengurangkan delaminasi dalam CNCC.
Menariknya, tahap pan-AKT telah dikurangkan secara in vitro dan in vivo sebagai tambahan kepada tahap 473-AKT terfosforilasi jika tiada SPECC1L, mencadangkan peraturan isyarat PI3K-AKT pada tahap kestabilan atau perolehan protein AKT.Gen SPECC1L dan MID1, kedua-duanya dikaitkan dengan sindrom Opitz/GBBB, mengekod protein yang menstabilkan mikrotubul 18,22 .Mekanisme yang mana SPECC1L dan MID1 menengahi penstabilan microtubule tidak difahami sepenuhnya.Dalam kes SPECC1L, penstabilan ini termasuk asetilasi yang dipertingkatkan bagi subset mikrotubul 18 .Ada kemungkinan SPECC1L menggunakan mekanisme yang sama untuk menstabilkan protein lain seperti AKT.Telah ditunjukkan bahawa asetilasi sisa lisin dalam protein AKT membawa kepada penurunan dalam penyetempatan membran dan fosforilasi38.Di samping itu, ubiquitination rantai K63 pada residu lisin yang sama pada AKT diperlukan untuk penyetempatan dan pengaktifan membrannya39,40.Antara beberapa faktor yang berinteraksi dengan protein SPECC1L yang dikenal pasti dalam pelbagai skrin dua-hibrid yis throughput tinggi, empat - CCDC841, ECM2942, APC dan UBE2I43 - telah terlibat dalam perolehan atau kestabilan protein melalui ubiquitination atau sumoylation.SPECC1L mungkin terlibat dalam pengubahsuaian pasca translasi sisa lisin AKT, yang menjejaskan kestabilan AKT.Walau bagaimanapun, peranan kritikal SPECC1L dalam penyetempatan dan kestabilan protein AKT masih perlu dijelaskan.
Kecacatan teruk dalam ekspresi SPECC1L dalam vivo mengakibatkan peningkatan pewarnaan penanda AJ dan tindanan CNCC yang rosak, serta peningkatan apoptosis dan kematian embrio awal.Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahawa mutan tetikus dengan peningkatan tahap apoptosis dikaitkan dengan kecacatan tiub saraf 44,45,46,47 dan kecacatan kraniofasial48.Telah dicadangkan bahawa kematian sel yang berlebihan dalam lipatan saraf atau gerbang pharyngeal boleh mengakibatkan bilangan sel yang tidak mencukupi yang diperlukan untuk pergerakan morfogenetik yang betul 48,49,50.Sebaliknya, garisan sel kekurangan SPECC1L kami dengan ekspresi SPECC1L yang dikurangkan sederhana menunjukkan hanya perubahan AJ tanpa bukti peningkatan kematian sel.Walau bagaimanapun, perencatan kimia laluan PI3K-AKT dalam sel Kd ini telah mengakibatkan peningkatan apoptosis.Oleh itu, penurunan sederhana dalam ekspresi atau fungsi SPECC1L memastikan kelangsungan hidup sel.Ini konsisten dengan pemerhatian bahawa embrio mutan Specc11 yang jarang ditangkap yang terlepas dari penangkapan pada st.E9.5—mungkin disebabkan kecekapan penangkapan gen yang berkurangan—dapat menutup tiub neural mereka dan berhenti kemudian dalam pembangunan, selalunya dengan kecacatan kraniofasial (Rajah S3).Juga selaras dengan ini ialah kejadian jarang berlaku bagi embrio Specc1l heterozigot dengan keabnormalan kraniofasial—mungkin disebabkan oleh peningkatan kecekapan penangkapan gen—serta penemuan dalam ikan zebra di mana salah satu daripada dua ortolog SPECC1L (specc1lb) menyebabkan fenotip embrio lewat, termasuk kehilangan rahang bawah dan celah dua hala51.Oleh itu, mutasi kehilangan fungsi SPECC1L heterozigot yang dikenal pasti dalam pesakit manusia boleh menyebabkan kemerosotan kecil dalam fungsi SPECC1L semasa morfogenesis kraniofasial, mencukupi untuk menjelaskan celah orofasial mereka.Peraturan berasaskan SPECC1L hubungan antara sel juga boleh memainkan peranan dalam palatogenesis dan gabungan gerbang faring.Kajian lanjut mengenai fungsi SPECC1L akan membantu menjelaskan peranan hubungan antara sel sementara dalam CNCC semasa penutupan tiub saraf dalam motilitas sel neuroepithelial dan morfogenesis kraniofasial.
Kawalan osteosarcoma U2OS dan sel SPECC1L-kd telah diterangkan sebelum ini (Saadi et al., 2011).Antibodi terhadap SPECC1L juga telah dicirikan sebelum ini (Saadi et al., 2011).Antibodi anti-β-catenin (arnab; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (tetikus; 1:1000; Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA), caspase 3 (1:1000; Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA) dan β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) digunakan seperti yang diterangkan..Filamen aktin telah diwarnai dengan Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Sel kawalan U2OS dan sel SPECC1L-kd telah dibiakkan dalam DMEM glukosa tinggi standard ditambah dengan 10% serum lembu janin (Life Technologies, Carlsbad, CA).Untuk perubahan AJ, 2 x 105 sel telah disemai pada kaca yang dirawat dengan gelatin babi 0.1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dan diperhatikan untuk perubahan dalam bentuk sel.Sel dikumpulkan pada titik masa yang berbeza yang ditunjukkan: 4 jam selepas pembenihan (t = 1), 24 jam selepas pembenihan (t = 2), pertemuan tanpa perubahan dalam bentuk sel (t = 3), perubahan dalam bentuk sel (t = 4) , 24 jam selepas perubahan bentuk sel (t = 5) dan 48 jam selepas perubahan bentuk sel (t = 6) (Rajah 1, 2, 3).Untuk memodulasi laluan PI3K-AKT, sel telah dibiakkan pada kepekatan yang ditunjukkan dengan wortmannin perencat PI3K-AKT (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) atau pengaktif SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Medium yang mengandungi bahan kimia ditukar setiap hari.
Rakaman bingkai demi bingkai dibuat pada kawalan langsung dan sel KD dalam keadaan kultur normal, dan imej kontras fasa dikumpul setiap 10 minit selama 7 hari.Imej diperoleh menggunakan mikroskop terbalik Leica DM IRB dikawal komputer yang dilengkapi dengan peringkat mekanikal dan objektif 10 × N-PLAN yang disambungkan kepada kamera QImaging Retiga-SRV.Semasa pengimejan, kultur sel dikekalkan pada 37°C dalam suasana lembap dengan 5% CO2.
Dua garisan sel ES perangkap gen DTM096 dan RRH048 dari Pusat Sumber Tetikus Mutant Serantau (UC Davis, CA) telah digunakan untuk menjana garis tetikus kekurangan Specc11, Specc1lgtDTM096 dan Specc1lgtRRH046 yang ditetapkan.Secara ringkas, 129/REJ ES sel telah disuntik ke dalam blastokista C57BL6.Tikus jantan chimeric yang terhasil telah dibiakkan dengan tikus C57BL6 betina untuk mengenal pasti anak dengan pewarnaan kot agouti.Kehadiran sisipan vektor perangkap gen digunakan untuk mengenal pasti heterozigot.Tikus disimpan pada latar belakang bercampur 129/REJ;C57BL6.Lokasi tapak penyisipan vektor perangkap genetik telah disahkan oleh RT-PCR, penjujukan genom, dan pelengkap genetik (Tambahan Rajah 1).Untuk mengesan keturunan CNCC tikus Specc1lGT heterozigot berganda, tikus ROSAmTmG (#007576) dan Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) telah disilangkan untuk menghasilkan alel ROSAmTmG dan Wnt1-Cre dalam mutant Specc1osl.Semua eksperimen pada tikus dilakukan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Pusat Perubatan Universiti Kansas.
Embrio telah ditetapkan dalam (1% formaldehid, 0.2% glutaraldehid, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) selama 60 minit pada suhu bilik.Selepas penetapan dalam larutan pewarnaan X-gal (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Pembangunan noda dilakukan pada 37°C .°C dalam masa 1-6 jam.Embrio telah diperbaiki selepas 4% PFA dan divisualisasikan.
Untuk Western blotting, sel telah dilisiskan dalam penimbal lisis pasif (Promega, Fitchburg, WI) ditambah dengan campuran perencat protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates diproses pada 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX gel siap (Bio-Rad, Hercules, CA) dan dipindahkan ke membran Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Membran telah disekat dalam 5% susu dalam PBS yang mengandungi 0.1% Tween.Antibodi diinkubasi semalaman pada suhu 4°C atau selama satu jam pada suhu bilik.Reagen Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) telah digunakan untuk penjanaan isyarat.Untuk immunostaining, embrio telah ditetapkan semalaman dalam 4% PFA/PBS dan cryopreserved.Cryosections tisu disekat dalam PBS yang mengandungi 1% serum kambing biasa (Thermo Scientific, Waltham, MA) dan 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dan kemudian diinkubasi pada 4°C dalam inkubator semasa malam.dengan anti-antibodi dan antibodi sekunder pendarfluor (1:1000) selama 1 jam pada 4°C.Bahagian bernoda diletakkan dalam medium emas ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) dan imej rata diperoleh menggunakan mikroskop confocal Leica TCS SPE.Setiap imunostaining dilakukan sebagai tiga eksperimen bebas pada cirossections sekurang-kurangnya dua embrio mutan.Percubaan perwakilan ditunjukkan.
Sel-sel telah diinkubasi dalam penampan RIPA yang diubah suai (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliserol, 2 mM EDTA, dan perencat protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Secara ringkas, lisat telah diprapurifikasi dengan manik magnet protein G (Life Technologies, Carlsbad, CA) dan kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4° C. dengan manik protein anti-SPECC1L atau IgG protein G digunakan untuk mengekstrak SPECC1L dan Western blotting dilakukan menggunakan anti Antibodi -β-catenin yang diterangkan di atas Eksperimen co-IP yang ditunjukkan mewakili empat eksperimen bebas.
Sel kultur tetap atau tisu embrio tetikus telah disediakan ke pusat mikroskop elektron di Pusat Perubatan Universiti Kansas.Secara ringkas, sampel dibenamkan dalam resin EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), dipolimerkan semalaman pada suhu 60 ° C, dan dipotong pada 80 nm menggunakan ultramicrotome Leica UC7 yang dilengkapi dengan bilah berlian.Bahagian telah divisualisasikan menggunakan mikroskop elektron penghantaran JEOL JEM-1400 yang dilengkapi dengan pistol Lab6 100 kV.
Cara memetik artikel ini: Wilson, NR et al.Kekurangan SPECC1L membawa kepada peningkatan kestabilan sendi yang disambung dan pengurangan penembusan sel puncak saraf kranial.Sains.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induksi dan pembezaan puncak saraf.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Sel-sel puncak saraf kranial dalam gerakan: peranan mereka dalam perkembangan kraniofasial.American Journal of Medical Genetics.Bahagian A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: pertumbuhan dan perkembangannya selama 20 tahun.Pakar Pediatrik.patologi.makmal.ubat.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU dan Noten MM Terobosan dalam genetik celah orofasial.Trend dalam Perubatan Molekul 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. dan Riley, FM Mekanisme molekul penghijrahan sel puncak neural kranial dan corak semasa perkembangan kraniofasial.Pembangunan 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH dan Murray, JK Sumbing bibir dan lelangit: memahami pengaruh genetik dan persekitaran.komen semula jadi.Genetik 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfogenesis yang tidak normal pada kulit, anggota badan, dan kawasan kraniofasial dalam tikus kekurangan faktor-6 (Irf6) yang mengawal selia interferon.Genetik Kebangsaan.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mutasi dominan dalam GRHL3 menyebabkan sindrom van der Waord dan menjejaskan perkembangan periderm mulut.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ dan Juriloff, DM Kemas kini senarai mutan tetikus dengan kecacatan pada penutupan tiub neural dan kemajuan ke arah pemahaman genetik yang lengkap tentang penutupan tiub saraf.Penyiasatan kecacatan kelahiran.Bahagian A, Teratologi Klinikal dan Molekul 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Isyarat PDGFRalpha pengantara PI3K mengawal kelangsungan hidup dan percambahan dalam pembangunan rangka melalui laluan intrasel yang bergantung kepada p53.Perkembangan Gen 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND dan Murdoch, JN Disheveled: Hubungan pengembangan konvergen dengan penutupan tiub neural.Trend dalam neurologi.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).