Komponen kimia tiub bergelung keluli tahan karat 347, Pengenalpastian protein pendamping leukosit manusia antigen-A (HLA-A) responsif interferon baru menggunakan spektrometri jisim berkait silang (CLMS)

Terima kasih kerana melawat Nature.com.Anda menggunakan versi penyemak imbas dengan sokongan CSS terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami menunjukkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Peluncur menunjukkan tiga artikel setiap slaid.Gunakan butang belakang dan seterusnya untuk bergerak melalui slaid, atau butang pengawal slaid di hujung untuk bergerak melalui setiap slaid.

Penerangan Produk

Tiub Gegelung 347L Keluli Tahan Karat, Gred Keluli: SS347L

Sistem isyarat interferon mendorong tindak balas sitokin yang kuat kepada pelbagai isyarat patologi patogenik dan intrinsik daripada persekitaran, mengakibatkan induksi subset protein yang boleh diinduksi interferon.Kami menggunakan spektrometri jisim pautan silang pengantara DSS (CLMS) untuk mengesan interaksi protein-protein baharu dalam domain protein yang disebabkan oleh interferon.Sebagai tambahan kepada protein yang boleh diinduksi interferon yang dijangkakan, kami juga mengenal pasti tambahan intermolekul dan intramolekul baru yang berkait silang bagi protein yang boleh diinduksi interferon kanonik seperti MX1, USP18, OAS3, dan STAT1.Kami memberi tumpuan kepada pengesahan ortogonal set novel rangkaian protein interferon-inducible yang dibentuk oleh protein HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) menggunakan co-immunoprecipitation dan kajian lanjut mereka menggunakan pemodelan dinamik molekul.Pemodelan dinamik konformasi kompleks protein mendedahkan beberapa tapak interaksi yang mencerminkan interaksi yang dikenal pasti dalam penemuan CLMS.Bersama-sama, kami membentangkan kajian perintis CLMS untuk mengenal pasti kompleks isyarat baharu yang disebabkan oleh interferon, dan menantikan penggunaan CLMS yang lebih meluas untuk mengenal pasti dinamik baharu interaksi protein dalam persekitaran mikro tumor.
Sebelum tindak balas imun adaptif bermula, sistem pertahanan semula jadi hos memasang tindak balas antimikrobial yang dimediasi oleh keluarga sitokin alfa-heliks yang dirembeskan dipanggil interferon (IFN).Kelas IFN jenis I IFNα dan IFNβ mengaktifkan tindak balas selular, termasuk keadaan antivirus, proapoptotik, proinflamasi dan antiproliferatif.Pada manusia, 13 subtipe IFNα diketahui, semuanya berkelompok pada kromosom 91. Yang menghairankan, hanya IFNα2 telah dikaji untuk kegunaan klinikal.Baru-baru ini, perhatian khusus telah diberikan kepada penyelidikan tentang subtipe lain IFNα.Satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa IFNα14 adalah salah satu isoform yang paling berkesan dalam menyekat replikasi HBV2 dan HIV-13,4 berbanding subjenis IFNα2 kanonik.
Telah ditetapkan bahawa kompleks reseptor interferon jenis I yang diaktifkan (IFNAR1 dan IFNAR2) mencetuskan lata transduksi isyarat yang dimediasi oleh Janus kinase TYK2 dan JAK15,6.Transduser isyarat fosforilat Janus kinase ini dan pengaktif protein transkrip (STAT1 dan STAT2) pada sisa tirosin untuk memulakan heterodimerisasi pengantara domain SH26.Selepas itu, IRF9 mengikat heterodimer STAT untuk membentuk kompleks trimerik bagi gen faktor 3 yang dirangsang IFN (ISGF3), yang dipindahkan ke nukleus dan mendorong transkripsi lebih daripada 2000 gen yang dirangsang interferon (ISG)5,6,7,8.
ISG membentuk tulang belakang sistem imun semula jadi, terutamanya sebagai tindak balas kepada serangan virus.Sebagai barisan pertahanan pertama terhadap jangkitan virus, sel dengan pantas menggunakan interaksi meluas protein selular dengan pelbagai aktiviti biologi.Protein ini termasuk reseptor pengecaman corak, molekul isyarat, faktor transkripsi dan protein dengan fungsi antivirus langsung, serta pengawal selia negatif tindak balas imun9.Kebanyakan maklumat mengenai aktiviti ISG datang daripada skrin berfungsi menggunakan skrin overexpression10,11 atau teknik pembungkaman gen (siRNA, RNAi dan CRISPR)12,13 di mana ISG individu dinyatakan atau dihalang dan aktivitinya diuji pada pelbagai virus.Walaupun kajian ini telah menentukan sifat antivirus ISG individu, mekanisme molekul asas setiap ISG masih tidak diketahui.Secara amnya diterima bahawa banyak protein berinteraksi dengan satu atau lebih sitokin untuk memastikan aktiviti penuh, jadi sama ada ISG berinteraksi secara langsung atau interaksi mereka dimediasi oleh protein selular.Sebagai contoh, kajian proteomik fotocrosslinked baru-baru ini mengenal pasti ATPase VCP/p97 sebagai rakan interaksi utama IFITM3, yang perencatannya membawa kepada kecacatan dalam pengisihan lisosom, perolehan dan pengangkutan bersama IFITM3 dengan zarah virus 14 .Dengan menggunakan immunoprecipitation, kami mengenal pasti VAPA, protein yang berkaitan dengan vesikel, sebagai rakan interaksi dengan IFITM1/2/3 yang mengantara kematangan virus pengantara kolesterol, dan ini telah disahkan oleh kajian lain menggunakan sistem dua hibrid yis.Sokongan Saintifik 15 , 16 .
Proses biologi asas yang terlibat dalam penindasan jangkitan dan transformasi malignan ialah persembahan antigen, yang dimediasi oleh molekul kompleks histokompatibiliti utama (MHC).Peptida (8-12 asid amino panjang) daripada protein yang dibelah, ditamatkan sebelum waktunya atau tersalah lipat dimuatkan ke dalam heterodimer MHC-I (terdiri daripada rantai berat dan ringan MHC-I, dipanggil β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18 .Trimer MHC-I yang stabil yang terhasil diangkut ke permukaan sel, di mana ia membentangkan peptida intraselular kepada sel T CD8+ (sel T sitotoksik)17.Sel T mengenali dan memusnahkan patogen dan sel yang membawa antigen khusus tumor ini.Akibatnya, patogen dan sel tumor sering menyekat proses pembentangan antigen untuk mengelakkan pengawasan imun.Di samping itu, MHC-I dikurangkan dalam 40-90% tumor manusia dan sering dikaitkan dengan prognosis yang lebih buruk19.
Gen yang terlibat dalam bertindak balas kepada patogen mesti cepat bertukar antara keadaan rehat dan keadaan transkripsi aktif.Oleh itu, beberapa protein selular dihipotesiskan terlibat dalam tindak balas kepada permintaan IFN yang tinggi dalam jangka masa yang singkat, termasuk pembentukan semula dan pengubahsuaian kromatin promoter 20,21 .Kebanyakan kajian telah memberi tumpuan kepada pengenalpastian pasangan protein ISG individu dengan kehadiran IFN.Beberapa kajian proteomik dan transkriptik dalam sistem sel model telah menjelaskan kesan IFN pada landskap selular.Walau bagaimanapun, walaupun pemahaman yang semakin meningkat tentang dinamik yang disebabkan oleh interferon, kami masih mengetahui sedikit tentang penglibatan ISG.Apabila mempertimbangkan kerumitan dan dinamik bergantung masa bagi isyarat interferon, dua persoalan timbul: (i) adakah mungkin untuk menstabilkan dan memerangkap kompleks multiprotein yang terlibat dalam isyarat pantas, dan (ii) bolehkah interaksi ini dipetakan ke dalam ruang 3D?
Untuk menangani isu ini, kami melaksanakan pautan silang kimia suberate-mediated disuccinimide (DSS) ditambah dengan spektrometri jisim (CLMS) untuk mengkaji rangkaian interaksi protein yang disebabkan oleh IFNα dan dinamiknya.DSS menambah ikatan kovalen antara sisa proksimal protein dan/atau kompleks protein dalam vivo.Analisis MS seterusnya mendedahkan tapak silang silang tertentu yang mencerminkan kedekatan spatial kawasan dalam protein tertentu, dipanggil pautan dalaman, atau subunit dalam kompleks protein, dipanggil saling hubungan.Menggunakan pendekatan ini, kami telah mengenal pasti beberapa kompleks protein-protein novel serta rangkaian interaksi multiprotein yang disebabkan oleh interferon.Dengan menguji selanjutnya subset interaksi baharu ini, kami menunjukkan bahawa H2BFS (FS jenis histon H2B; selepas ini dirujuk sebagai H2B) dan MDN1 bertindak sebagai rakan kongsi yang mengikat untuk HLA-A.
Sel Flo-1 adalah salah satu model in vitro adenokarsinoma esofagus yang paling terkenal kerana ia meniru ciri utama tumor esofagus22,23.Walau bagaimanapun, tidak semua tumor adalah imunogenik, dan untuk menentukan sama ada sel Flo-1 bertindak balas terhadap rawatan interferon, kami merawat sel Flo-1 dengan 10 ng/ml IFNα selama 72 jam.Sel Flo-1 menunjukkan induksi awal pSTAT1 dan IRF1, bermula 2 jam selepas rawatan dan berterusan selama 72 jam, dengan penurunan bergantung pada masa dalam tahap pegun IRF1 (Rajah 1A).ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2, dan ISG15) didapati sangat terdorong selepas 6 jam, meniru tindak balas fasa pertengahan dan lewat klasik kepada IFNα (Rajah 1A).Bersama-sama, data ini mencadangkan bahawa model selular ini boleh digunakan untuk mengkaji tindak balas interferon.
Tindak balas ekspresi protein berbeza dalam sel Flo-1 selepas rawatan IFNα.(A) Ekspresi protein dalam sel Flo-1 yang dirawat dengan 10 ng/ml IFNα selama 2, 6, 24, 48 dan 72 jam dianalisis oleh imunoblot menggunakan antibodi ISG yang ditunjukkan.(B) Gel SDS-PAGE berwarna biru Coomassie bagi ekstrak seluruh sel selepas memaut silang dengan DSS untuk masa dan kepekatan yang ditunjukkan.(C) Imunoblot perwakilan diperiksa dengan antibodi p53(DO-1) daripada sampel yang sama untuk menilai tahap penghubung silang protein.
Untuk menangkap landskap interaksi protein in situ, kami menggunakan DSS, agen penghubung silang yang digunakan secara meluas kerana kebolehtelapan membran yang tinggi dan masa tindak balas yang agak singkat.Masa tindak balas yang lebih pendek membantu menghalang pembentukan agregat besar protein bersilang, dengan itu mengekalkan kestabilan penghubung silang.Untuk menentukan kepekatan DSS yang optimum dan mengelakkan hubungan silang yang berlebihan, kami mula-mula mendedahkan sel kepada 5, 2.5, dan 1 mM DSS selama 5, 10, 5, dan 30 minit, masing-masing, dan menganalisis lisat oleh SDS-PAGE yang diwarnai Coomassie (data tidak ditunjukkan) .Lisat sel kelihatan sangat berkait silang pada kepekatan terendah dan pada titik masa terpendek.Oleh itu, DSS telah dititrasi kepada 1, 0.5, dan 0.1 mM selama 5 minit (Rajah 1B).Pautan silang optimum diperhatikan dengan 0.5 mM DSS selama 5 minit, dan keadaan ini dipilih untuk sel yang dirawat dengan IFNα.Di samping itu, Rajah 1C menunjukkan Western blot dilakukan menggunakan antibodi p53 (DO-1) untuk menilai tahap penghubung silang protein.
Sel Flo-1 telah dirawat dengan 10 ng/ml IFNα selama 24 jam sebelum menambah pemaut silang.Sel berkait silang kemudiannya dilisiskan oleh proteolisis dua langkah dan protein diproses oleh FASP (Rajah 2)24,25.Peptida tryptik silang silang telah dianalisis dengan spektrometri jisim (Rajah 2).Spektrum MS/MS kemudiannya dipadankan dengan jujukan protein dan dikira dengan MaxQuant26,27.Peptida bersilang dikenal pasti daripada spektrum yang diperoleh menggunakan program SIM-XL, dan sebatian individu digabungkan ke dalam rangkaian kompleks menggunakan saluran paip perisian pengkomputeran sumber terbuka xQuest28 dan SIM-XL29 (Rajah 2).SIM-XL mengenal pasti interaksi protein-protein, rantai dalaman dan rantai individu dalam campuran protein ringkas atau kompleks dan menyediakan skrip untuk menggambarkan interaksi dalam struktur protein.Selain itu, ia meletakkan setiap rujukan silang sebagai skor ID mengikut kualiti spektrum MS/MS29.Beberapa interaksi dan kompleks protein-protein yang sangat dipercayai telah dikenal pasti, dan satu set interaksi baharu telah disiasat lebih lanjut menggunakan co-imunoprecipitation dan perubahan konformasi kompleks menggunakan pemodelan dinamik molekul (MD) (Rajah 2) 30, 31.
Gambaran keseluruhan skema kaedah CLMS.Sel Flo-1 dirawat dengan 10 ng/ml IFNα selama 24 jam diikuti dengan penyambung silang protein in situ menggunakan DSS diikuti dengan lisis sel dan trypsinization.Sampel berkait silang dianalisis menggunakan spektrometer jisim Orbitrap dan selanjutnya diambil sampel untuk pemecahan prekursor peptida semasa LC-MS/MS.Dua peptida berpaut telah dikenal pasti daripada spektrum yang diperoleh menggunakan Mesin Pengecaman Spektrum bagi program Peptida Berpaut Silang (SIM-XL), dan semua sebatian telah digabungkan ke dalam rangkaian kompleks menggunakan saluran paip pengiraan.Tapis interaksi keyakinan rendah berdasarkan skor kadar positif palsu (FDR).Beberapa interaksi protein-protein kesetiaan tinggi yang baru telah disahkan lagi menggunakan co-imunoprecipitation, dan perubahan konformasi dalam kompleks telah diperiksa menggunakan pemodelan dinamik molekul (MD).
Sebanyak ~30,500 dan ~28,500 peptida dikesan menggunakan MaxQuant dalam sampel IFNα yang tidak dirangsang dan dirangsang (Jadual Tambahan S1, Rajah 3A).Taburan panjang peptida dalam kedua-dua kes menunjukkan bahagian peptida yang lebih besar yang lebih tinggi, menunjukkan kehadiran peptida berkait silang (Rajah 3B, C).Di samping itu, sebahagian besar peptida yang lebih besar terdapat dalam julat 40-55 dalam sampel yang dirawat IFNα (Rajah 3C).Pemetaan protein terhadap keamatan log2 menunjukkan bahawa protein yang dirangsang interferon klasik adalah yang paling banyak berbanding dengan sampel yang tidak dirawat, termasuk MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, dan HLA-F (Rajah 3D).Analisis laluan untuk protein lebih daripada tiga kali ganda diperkaya sebagai tindak balas kepada rawatan IFNα menggunakan pangkalan data laluan Reactome menunjukkan bahawa pembentangan dan pemprosesan antigen pengantara MHC-I adalah laluan yang paling dominan (Rajah 3E).Selaras dengan laporan terdahulu, tindak balas antivirus yang dimediasi oleh OAS dan ISG15 serta isyarat IFNα/β dan sitokin adalah antara laluan yang diaktifkan.Di samping itu, pautan silang protein khusus lisin dan serine telah dikenal pasti daripada spektrum MS / MS yang diperoleh menggunakan SIM-XL.Kajian baru-baru ini melaporkan 104 ISG merangkumi 20 virus daripada 9 kelas virus melalui meta-analisis kajian overexpression ISG individu dalam 5 jenis sel9.Walau bagaimanapun, untuk mengatasi batasan pengiraan untuk menyaring set data yang besar, kami bermula dengan set data yang lebih kecil untuk meneroka kemungkinan interaksi antara senarai gen IRDS yang dilaporkan oleh Padaria et al., yang kebanyakannya adalah ISG.
Pengenalpastian protein berkait silang yang dinyatakan secara berbeza sebagai tindak balas kepada IFNα (data diperoleh daripada MaxQuant).(A) Gambar rajah Venn yang mewakili bilangan peptida biasa dan eksklusif yang dikenal pasti dalam sampel Flo-1 yang dirawat dan tidak dirawat IFNα14.Taburan panjang peptida bagi sampel bersilang (B) dan IFNα yang dirawat (C) yang tidak dirawat.(D) Peta haba yang mewakili log2 (keamatan LFQ) antara sel Flo-1 yang tidak dirawat dan IFNα14 yang dirawat.Panel kiri menunjukkan protein yang paling aktif diaktifkan dengan kehadiran IFNα.(E) Histogram yang mewakili 20 laluan pengayaan utama selepas rawatan IFNα.Pangkalan data laluan Reactome menganalisis lebih daripada empat kali ganda perubahan dalam protein responsif IFNα yang dikawal selia.
Rangsangan ISG pengantara interferon didokumentasikan dengan baik, tetapi pada tahap molekul kurang difahami bagaimana protein ini memuncak dalam pelbagai fungsi biologi.Kami menyiasat interaksi protein dengan tahap keyakinan yang tinggi antara ISG yang diketahui.Menariknya, kami mengenal pasti rangkaian termasuk protein MX1, USP18, ROBO1, OAS3, dan STAT1 yang membentuk kompleks besar sebagai tindak balas kepada rawatan IFNα (Rajah 4, Jadual S2) 32,33,34.Paling penting, interaksi ini ditemui dalam semua tiga kali ganda yang dirawat dengan IFNα dan tidak ditemui dalam sampel yang tidak dirawat, menunjukkan bahawa ia terbentuk secara khusus sebagai tindak balas kepada rawatan IFNα.Adalah diketahui bahawa STAT1 secara transkripsi mengawal ekspresi ISG ini, tetapi interaksinya dengan ISG pada tahap protein belum dipelajari.Struktur kristal STAT1 menunjukkan bahawa domain heliksnya (CCD) tidak terlibat dalam interaksi dengan DNA atau protomer semasa pembentukan dimer35.α-heliks ini membentuk struktur heliks heliks yang menyediakan kawasan permukaan yang kebanyakannya hidrofilik untuk interaksi berlaku 35 .Dalam data CLMS kami, kami mendapati bahawa kebanyakan interaksi dengan STAT1 berlaku dalam domain SH2 sebelum CCD, domain penghubung, atau ekor terminal C (residu 700-708) (Rajah 4A).Kajian terdahulu melaporkan bahawa USP18 mengikat kepada CCD dan domain pengikat DNA (DBD) STAT2 dan direkrut ke subunit reseptor interferon jenis I IFNAR2 untuk menengahi perencatan isyarat interferon jenis I 24 .Data kami juga menunjukkan bahawa domain pemangkin USP18 berinteraksi dengan STAT1 DBD (Rajah 4A, D), menunjukkan bahawa kedua-dua STAT1 dan STAT2 mungkin memainkan peranan dalam menarik USP18 ke IFNAR2.
Rangkaian ISG protein-protein yang dikenal pasti dalam sel bersilang yang dirawat dengan IFNα.(A) Plot interaksi 2D menunjukkan interaksi protein-protein (dijana dalam program SIM-XL), dengan garis yang mewakili interaksi antara molekul (potongan pautan silang ditetapkan kepada 3.5).Domain identiti berbeza ditandakan dengan warnanya32: domain MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) dan GED (569–660).Domain OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) dan OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) dan fn3 (777–864).Medan STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) dan STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Pemapar bulat protein berkait silang (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, dan STAT1) masing-masing dengan interaksi dan interaksi dilabelkan dengan warna biru dan merah.Ambang pautan silang ditetapkan pada 3.5.Plot titik menunjukkan tapak interaksi STAT1 dengan MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), dan OAS3 (F), serta tapak interaksi K atau S antara kedua-dua peptida.Dalam rajah, ambang skor pautan silang ditetapkan kepada 3.0.(G) Pelbagai tapak interaksi antara domain STAT1 dan OAS3 DI yang ditindih pada struktur proteinnya dalam PyMol (sistem grafik molekul PyMOL, versi 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (id pdb: 1bf533) dan OAS3 (id pdb: 4s3n34).) program.
Dua isoform USP18 telah diterangkan pada manusia, protein panjang penuh yang kebanyakannya terletak di dalam nukleus, dan isoform tanpa domain terminal-N, USP18-sf, yang diagihkan sama rata dalam sitoplasma dan nukleus 36 .Di samping itu, terminal-N diramalkan tidak berstruktur dan tidak memerlukan aktiviti isopeptidase atau pengikatan ISG1537.Kebanyakan interaksi yang dikenal pasti dalam kajian kami terletak di terminal N protein, menunjukkan bahawa interaksi ini melibatkan USP18 penuh (Rajah 4A, D) dan dengan itu mungkin berlaku dalam nukleus.Selain itu, data kami juga menunjukkan bahawa N-terminus khusus untuk interaksi protein-ke-protein.Tapak pengikatan IFNAR2 terletak di antara sisa 312-368, dan terutamanya, tiada satu pun daripada protein dalam kompleks terikat pada rantau ini (Rajah 4A) 37,38 .Data ini diambil bersama menunjukkan bahawa domain pengikat IFNAR2 digunakan secara eksklusif oleh protein reseptor.Di samping itu, hanya OAS3 dan ROBO1 didapati dikaitkan dengan domain hulu tapak pengikat N-terminus dan IFNAR2 (Rajah 4A).
ROBO1 tergolong dalam superfamili imunoglobulin (Ig) molekul isyarat transmembran dan terdiri daripada lima domain Ig dan tiga domain fibronektin (Fn) di kawasan ekstraselular.Domain ekstraselular ini diikuti oleh kawasan proksimal membran dan heliks transmembran tunggal 39. Kawasan intrasel yang tidak berstruktur terletak di terminal-C dan mengandungi motif jujukan terpelihara yang menjadi pengantara pengikatan protein effector39.Rantau yang meluas dari asid amino ~ 1100 hingga 1600 kebanyakannya tidak teratur.Kami mendapati bahawa MX1 berinteraksi dengan ROBO1 melalui Ig, Fn dan domain intrasel, manakala kebanyakan interaksi dengan STAT1 berlaku antara CCD, domain penghubung dan terminal C ROBO1 (Rajah 4A, E).Sebaliknya, interaksi dengan kawasan penghubung DI, DIII, dan OAS3 telah diedarkan ke seluruh protein ROBO1 (Rajah 4A).
Keluarga protein oligoadenylate synthase (OAS) menerima dan mengikat RNA untai dua intraselular (dsRNA), mengalami perubahan konformasi, dan mensintesis oligoadenylates berkait 2',5' (2-5 As) 40 .Didapati bahawa antara tiga OAS, OAS3 mempamerkan pertalian tertinggi untuk dsRNA dan mensintesis jumlah paling sedikit 2-5 As, yang boleh mengaktifkan RNase L dan dengan itu mengehadkan replikasi virus 41 .Keluarga OAS terdiri daripada domain pemindahan nukleotida seperti polimerase beta (pol-β).Penyelidikan terdahulu telah menunjukkan bahawa aktiviti pemangkin domain C-terminal (DIII) bergantung pada domain pengikat dsRNA (DI), yang diperlukan untuk pengaktifan OAS342.Kami mendapati bahawa domain DI dan DII OAS3 berinteraksi dengan CCD dan kawasan persimpangan kecil antara SH2 dan STAT1 TAD (Rajah 4A, F).Mentindih tapak silang silang yang berbeza pada struktur protein mendedahkan interaksi antara helaian β dan gelung DBD STAT1 dan poket terbuka atau rongga yang dibentuk oleh residu 60-75 dalam domain DI OAS3 (Rajah 4G).Orientasi protein dalam kompleks juga menunjukkan bahawa tiada interaksi dengan OAS3 mengganggu keupayaan mengikat DNA domain DInya (Rajah S1A).Di samping itu, domain N-terminal GTPase MX1 berinteraksi secara meluas dengan domain DI dan DIII OAS3 (Rajah 4A).Kami juga melihat interaksi antara OAS1 dan MX1 dalam ketiga-tiga ulangan yang dirawat IFNα, di mana satu domain OAS1 (juga aktif secara pemangkin) berinteraksi dengan ketiga-tiga domain MX1 (Rajah S2A, B).
Protein MX ialah sebahagian daripada keluarga besar GTPase seperti dynein yang mengandungi domain GTPase N-terminal yang mengikat dan menghidrolisis GTP, domain perantaraan yang menjadi pengantara pemasangan sendiri dan zip leucine terminal-C yang bertindak sebagai GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.MX1 mengikat kepada subunit polimerase virus untuk menyekat transkripsi gen virus43.Skrin dua hibrid ragi yang dilaporkan sebelum ini menunjukkan bahawa MX1 yang berkaitan dengan PIAS1 menghalang pengaktifan gen pengantara STAT1 dengan menyekat aktiviti mengikat DNA dan juga mempunyai aktiviti ligase SUMO E344,45.Di sini, kami menunjukkan bahawa MX1 mengikat kepada STAT1 (Rajah 4C, D), namun bagaimana interaksi ini mempengaruhi pengaktifan gen pengantara STAT1 sebagai tindak balas kepada IFNα memerlukan kajian lanjut.Di samping itu, kami juga mendapati bahawa MX1 berinteraksi dengan IFIT3 dan DDX60 dalam ketiga-tiga ulangan yang dirawat IFNα (Rajah S2C).
DDX60 ialah helikase sitoplasma yang disebabkan oleh IFN yang sebelum ini dilaporkan memainkan peranan dalam degradasi bebas RIG-I bagi RNA46 virus.Ia berinteraksi dengan RIG-I dan mengaktifkan isyaratnya dalam cara khusus ligan 46. DDX60 terdiri daripada domain helikas DEXD/H-Box dan domain helikas terminal-C yang mengikat RNA virus dan DNA47.Kebanyakan interaksinya dengan MX1 dan IFIT3 berlaku dalam kawasan terminal N dan C yang panjang tanpa domain atau motif kanonik (Rajah S2E, F).Walau bagaimanapun, MX1 juga dikaitkan dengan domain helikase DEXD/H-Box (Rajah S2E).Protein keluarga IFIT mempunyai salinan tandem motif heliks-putar-helix tersendiri yang dipanggil ulangan tetrapeptida (TPR).IFIT3 didapati sebagai modulator positif bagi isyarat RIG-I dan oleh itu merupakan komponen kompleks MAVS.Diambil bersama, data kami mencadangkan bahawa IFIT3 dan DDX60 berinteraksi terutamanya di rantau antara TPR 3–6 IFIT3 dan mungkin memainkan peranan dalam isyarat RIG-I/MAVS (Rajah S2F).
Memandangkan penyaringan keseluruhan proteom adalah intensif dari segi pengiraan, kami kemudiannya menapis keseluruhan pangkalan data UniProt manusia untuk kehadiran salah satu ulangan yang dirawat IFNα.Dalam replika ini, kami menemui beberapa rangkaian interaksi yang sangat dipercayai untuk HLA-A.Analisis laluan protein yang dikenal pasti oleh spektrum MS/MS menunjukkan bahawa pemprosesan dan pembentangan antigen berasaskan MHC-I adalah laluan utama yang disebabkan oleh interferon (Rajah 3D).Oleh itu, kami memberi tumpuan kepada mengkaji interaksi protein molekul MHC-I dengan tahap keyakinan yang tinggi dalam semua sampel silang silang.HLA terdiri daripada domain α1, α2 dan α3 dan rantai ringan, dan mikroglobulin β2 (β2m) ialah protein pendamping yang berterusan49.Setelah dipasang dalam retikulum endoplasma, HLA tidak stabil jika tiada ligan peptida50.Alur pengikat peptida dibentuk oleh domain α1 dan α2 yang sangat polimorfik dan tidak berstruktur dalam bentuk bukan peptida dan domain α351 polimorfik yang agak kurang.Dengan kehadiran IFNα, kami mengesan dua kompleks HLA-A: satu berinteraksi dengan HMGA1 dan H2B (Rajah 5, Jadual S3) dan yang lain berinteraksi dengan MDN1, LRCH4 dan H2B (Rajah 6).
IFNα mendorong rangkaian interaksi HLA-A dengan H2B (H2BFS) dan HMGA1.(A) Plot 2D (dijana dalam perisian SIM-XL) yang menggambarkan pelbagai jenis interaksi dalam kompleks H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (biru), interlink (merah) dan single link (hitam)..Domain identiti berbeza adalah berkod warna32: H2B (histone; 2–102) dan MHC-I (MHC_1; 25–203, kumpulan C1; 210–290 dan MHC_I_C; 337–364).Ambang pautan silang ditetapkan pada 3.5.Plot titik menunjukkan tapak interaksi HLA-A dengan H2B (B) dan HMGA1 (C), serta tapak interaksi K atau S antara kedua-dua peptida.Dalam rajah, ambang skor pautan silang ditetapkan kepada 3.0.(D) Hubungan antara protein yang ditunjukkan dalam struktur protein H2B, HLA-A, dan HMGA1 dalam program PyMOL.Struktur ini dimodelkan menggunakan pelayan Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) dan struktur templat untuk protein H2B, HLA-A dan HMGA1 masing-masing ialah 1kx552, 1kj349 dan 2eze55.
IFNα mendorong rangkaian interaksi HLA-A dengan H2B (H2BFS), MDN1 dan LRCH4.(A) Pautan silang intramolekul (merah) dan intermolekul (biru) dibentangkan pada peta interaktif 2D (dijana dalam perisian SIM-XL) dengan MDN1 diwakili sebagai bulatan.Ambang pautan silang ditetapkan pada 3.5.Domain identiti berbeza adalah berkod warna32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, kumpulan C1; 210–290 dan MHC_I_C; 337–364) dan LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) dan CH (535–641)).(B) Hubungan antara protein yang ditunjukkan dalam struktur protein H2B, HLA-A, LRCH4, dan MDN1 dalam program PyMOL.Struktur ini dimodelkan menggunakan pelayan Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) dengan struktur templat 1kx552, 1kj349, 6hlu62 dan 6i2665 untuk protein H2B, HLA-A, LRCH4 dan MDN1, masing-masing.Plot titik menunjukkan tapak interaksi K atau S untuk HLA-A dengan H2B (C), LRCH4 (D) dan MDN1 (E).Untuk plot, ambang skor pautan silang ditetapkan kepada 3.0.
Selain mengekalkan integriti genom, histon H2B juga terlibat dalam pengawalan transkripsi.Protein H2B terdiri daripada domain histon pusat (HFD) yang dibentuk oleh tiga heliks α yang dipisahkan oleh gelung dan ekor terminal C 41,52.Kebanyakan interaksi dengan H2B berlaku dalam heliks α1, yang menyediakan trimerisasi dengan heterodimer HFD (Rajah 5A, B).Walaupun lisin terlibat dalam pengikatan DNA, beberapa lisin juga merupakan tapak asetilasi atau metilasi alternatif.Sebagai contoh, sisa K43, K46, dan K57 daripada H2B tidak terlibat dalam pengikatan DNA langsung, tetapi merupakan sasaran pelbagai pengubahsuaian selepas transkripsi53.Begitu juga, sisa K44, K47, dan K57 dalam H2B mungkin memainkan peranan alternatif dengan kehadiran IFNα, termasuk interaksi dengan protein lain (Rajah 5A, B).Di samping itu, histon ekstrakromosomal H2B mengaktifkan tindak balas imun dalam pelbagai jenis sel, bertindak sebagai sensor sitosolik untuk mengesan serpihan DNA (dsDNA) berikat dua yang diperoleh daripada agen berjangkit atau sel yang rosak54.Dengan kehadiran virus DNA, pengurangan H2B menghalang pengeluaran IFN-β dan fosforilasi STAT154.H2B juga diketahui bergerak masuk dan keluar dari nukleus lebih cepat daripada histon teras lain54.Interaksi H2B dengan MDN1 dan LRCH4 juga diperhatikan dalam sampel yang tidak dirawat.Kami mendapati bahawa HLA-A berinteraksi dengan H2B dalam ketiga-tiga sampel yang dirawat IFNα dan dalam satu sampel ulangan yang tidak dirawat.Data ini mencerminkan peranan H2B dalam fungsi fisiologi alternatif yang bebas daripada peraturan transkrip.
HMGA1 (kumpulan mobiliti tinggi AT-Hook 1), nukleoprotein kecil yang kaya dengan asid amino penggalak penyakit, telah dikenal pasti bersama dengan HLA-A.Ia mempunyai ekor terminal C berasid dan tiga DBD berbeza yang dipanggil cangkuk AT kerana ia mengikat pada alur kecil kawasan kaya AT dalam dsDNA55,56.Pengikatan ini menyebabkan DNA membengkok atau meluruskan, membenarkan faktor transkripsi kanonik mengakses jujukan konsensusnya.Ekor terminal-C dipercayai terlibat dalam interaksi protein-protein dan pengambilan faktor transkripsi, kerana mutan penghapusan terminal-C tidak dapat memulakan transkripsi57.Selain itu, domain ini mengandungi beberapa tapak fosforilasi terpelihara yang dikenali sebagai substrat untuk kinase 58 .Kami memerhati interaksi HLA-A dan H2B dengan HMGA1 di luar domain terminal C, menunjukkan bahawa domain terminal C digunakan terutamanya untuk pengikatan faktor transkripsi (Rajah 5A, C).Protein HMGA bersaing dengan histon H1 untuk mengikat DNA penyesuai, dengan itu meningkatkan kebolehcapaian57.Begitu juga, nampaknya HMGA berinteraksi dengan histon H2B sepanjang DNA penghubung dalam persaingan dengan histon H1.HMGB1 mendorong ekspresi HLA-A, -B, dan -C dalam sel dendritik, yang membawa kepada pengaktifan mereka59, tetapi interaksi antara HMG dan HLA belum pernah dilaporkan sebelum ini.Kami mendapati bahawa HMGA1 berinteraksi dengan domain α1 dan α3 HLA-A, dengan kebanyakan interaksi di luar 3 DBD (Rajah 5A, C).Di tangan kami, HLA-A didapati disetempat dalam nukleus (data tidak ditunjukkan), dan memandangkan H2B dan HMGA1 juga terdapat dalam nukleus, interaksi ini mungkin berlaku dalam nukleus.Tambahan khusus yang diukur antara H2B, HLA-A dan HMGA1 ditunjukkan dalam Rajah 5D.
Kebanyakan interaksi HLA-A dengan protein lain berlaku dalam domain α1 dan α2 dan domain terminal C yang tidak teratur (Rajah 6).Dalam salah satu contoh ini, kami mendapati bahawa HLA-A berinteraksi dengan ekor N-terminal yang tidak teratur LRCH4 (Rajah 6A, D).LRCH4 mengawal pengaktifan TLR4 dan induksi sitokin LPS, dengan itu memodulasi tindak balas imun semula jadi60,61.Ia adalah protein membran dengan sembilan ulangan kaya leucine (LRR) dan motif homologi calmodulin (CH) dalam ektodomainnya, diikuti oleh domain transmembran (TMD) 60, 62 .Domain CH telah dilaporkan sebagai pengantara interaksi protein-protein 60 .Hamparan kira-kira 300 asid amino antara domain LRR dan CH agak boleh diakses tetapi tidak teratur.Berdasarkan fungsi kawasan bercelaru sebagai mediator rangkaian protein-protein dan pengangkutan vesikular 63, kami mendapati bahawa kebanyakan interaksi protein berlaku di kawasan bercelaru.Interaksi dengan MDN1 telah diedarkan ke seluruh panjang protein, termasuk domain LRR1, LRR6, CH dan kawasan rawak, manakala H2B terutamanya terikat kepada domain CH (Rajah 6A, B).Terutama, tiada interaksi termasuk TMJ, mencadangkan kekhususan pendekatan CLMS (Rajah 6A, B).
MDN1 juga telah dikenal pasti sebagai sebahagian daripada rangkaian protein HLA-A (Rajah 6A).Ia tergolong dalam keluarga protein AAA (ATPases yang dikaitkan dengan aktiviti yang berbeza).Ini ialah domain AAA N-terminal yang sama yang tersusun ke dalam gelang heksamerik dan mengalih keluar faktor pemasangan daripada subunit ribosom 60S 64.nampaknya serupa dengan dynein64,65,66.Di samping itu, kawasan kaya Asp/Glu diikuti oleh domain MIDAS (tapak bergantung kepada ion logam).Oleh kerana saiz MDN1 yang besar (kira-kira 5600 asid amino) dan homologinya yang terhad dengan protein yang dikaji dengan baik, sedikit yang diketahui tentang struktur dan fungsinya pada manusia.Kami mengenal pasti HLA-A, H2B, dan LRCH4 sebagai rakan kongsi pengikat MDN1 dan mendedahkan orientasi mereka sebagai kompleks protein dalam PyMol (Rajah 6A, B).Ketiga-tiga protein ini berinteraksi dengan domain AAA, domain penghubung seperti dynein, dan mungkin domain MIDAS MDN1.Dalam laporan sebelumnya, penulenan afiniti protein umpan mengenal pasti MDN1 sebagai protein yang dikaitkan dengan histon H2B67.Di samping itu, kajian baru-baru ini juga melaporkan interaksi antara MDN dan HLA-B dalam sel HCT116 menggunakan spektrometri jisim yang dimurnikan afiniti, menyokong penemuan kami68.Pengenalpastian kompleks ini dalam sampel yang dirawat IFNα mencadangkan peranan MDN1 dalam isyarat interferon.
Oleh kerana gen HLA sangat polimorfik, kami mengekstrak penjujukan bacaan pemetaan HLA-A, -B, dan -C daripada data penjujukan RNA sel Flo-1 (data tidak ditunjukkan).Urutan peptida yang konsisten dengan bacaan penjujukan mendedahkan perbezaan yang ketara antara HLA-A, -B, dan -C di kawasan di mana peptida bersilang terletak di HLA-A (Rajah S3).Di samping itu, kami tidak melihat hubungan silang protein-ke-protein molekul HLA-B/C dengan protein H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Ini menunjukkan bahawa interaksi protein yang terdapat antara HLA-A, MDN1, LRCH1 dan HMGA1 adalah khusus HLA-A.Di samping itu, analisis proteomik sampel tidak bersilang (Jadual S4) menunjukkan bahawa HLA-A mempunyai liputan jujukan yang lebih tinggi berbanding HLA-B atau HLA-C.Peptida yang dikenal pasti untuk HLA-A adalah tinggi dalam keamatan dalam kedua-dua sampel yang dirawat IFNα dan tidak dirawat.
Untuk memastikan bahawa interaksi yang dikenal pasti di sini bukan disebabkan oleh pautan silang yang tidak spesifik bagi dua protein dalam jarak spatial yang dekat, kami selanjutnya mengesahkan dua faktor interaksi HLA-A baharu dengan melakukan ujian co-immunoprecipitation.Interaksi HLA-A dengan MDN1 dan H2B endogen telah dikesan dalam kedua-dua sel Flo-1 yang dirawat IFNα dan tidak dirawat (Rajah 7, Rajah S4).Kami mengesahkan bahawa HLA-A telah ditangkap oleh H2B dalam immunoprecipitates dan bahawa persatuan ini disebabkan oleh rawatan IFNα sejak HLA-A tidak hadir dalam sampel immunoprecipitate daripada sel yang tidak dirawat (Rajah 7A).Walau bagaimanapun, data kami mencadangkan bahawa IFNα secara berbeza mengawal pengikatan HLA-A kepada H2B dan MDN1.IFNα mendorong perkaitan antara H2B dan HLA-A, tetapi mengurangkan perkaitannya dengan MDN1.Kami mendapati bahawa MDN1 dikaitkan dengan HLA-A dalam kawalan, dan penambahan IFNα mengurangkan interaksi ini bebas daripada induksi MDN1 oleh IFNα (Rajah 7B, C).Di samping itu, imunopresipitasi HLA-A menangkap H2B dalam sel A549 (Rajah S4), menunjukkan bahawa interaksi ini adalah bebas daripada jenis sel.Diambil bersama, keputusan ini menyokong interaksi pengantara interferon HLA-A dengan H2B dan MDN1.
HLA-A membersihkan bersama H2B dan MDN1.Imunoblot H2B (A) dan MDN1 (B) endogen yang mewakili telah diimunopresipitasi daripada sel Flo-1 yang dirawat IFNα dan menyiasat antibodi yang ditunjukkan.IgG tetikus dan arnab digunakan sebagai kawalan negatif.(C) Jumlah relatif (input) antigen yang berbeza digambarkan oleh imunoblot yang disiasat terhadap antibodi yang ditunjukkan, β-aktin digunakan sebagai kawalan pemuatan.
Ciri-ciri struktur salah satu rangkaian bersilang yang sangat dipercayai akibat interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, telah disiasat.Kami menggunakan pemodelan dinamik molekul sebagai pendekatan alternatif untuk memahami dinamik konformasi protein yang terlibat dalam kompleks ini (Rajah 8).Kesimpulan daripada data CLMS mencadangkan kemungkinan konformasi berbeza bagi protein H2B, HLA-A, dan HMGA1.Oleh itu, kompleks berpotensi berikut telah dimodelkan dalam medium pelarut: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, dan H2B-HLA-A-HMGA1.Skrin dok protein-protein awal menggunakan pakej MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) mencadangkan kemungkinan konformasi yang berbeza antara protein ini (Rajah 8A).Visualisasi kompleks protein dok mendedahkan beberapa interaksi dan kemungkinan konformasi (Rajah 5A, 8).Oleh itu, satu konformasi yang mungkin ditunjukkan dalam Rajah 8A (dengan pautan silang berlabel) dan ia dinilai selanjutnya menggunakan saluran paip pemodelan MD.Di samping itu, pengikatan H2B atau HMGA1 kepada HLA-A menyerlahkan pertalian H2B yang lebih tinggi untuk HLA-A (Rajah 8A).
Dinamik konformasi rangkaian yang mungkin antara kompleks H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A dan H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Panel kiri ialah peta 2D (dijana dalam perisian SIM-XL) pautan silang intramolekul (merah) dan antara molekul (biru) (potongan pautan silang ditetapkan kepada 3.5).Di samping itu, sisa penghubung silang yang dikenal pasti dilabelkan pada struktur protein H2B, HLA-A, dan HMGA1.Konformasi berkaitan protein ini diekstrak menggunakan saluran paip dok yang dilaksanakan dalam pakej MOE.Panel kiri bawah menunjukkan pelbagai kemungkinan konformasi kompleks H2B-HLA-A dan HMGA1-HLA-A dengan pertalian mengikat protein-protein yang berbeza (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Sisihan piawai (RMSD) kedudukan atom (tidak termasuk atom hidrogen) untuk setiap struktur protein.(C) Interaksi ikatan hidrogen protein-protein antara molekul daripada pelbagai kompleks simulasi mempertimbangkan interaksi khusus tempoh ≥ 10 ns.Jarak pemotongan penderma-penerima ikatan-h ditetapkan kepada 3.5 Å, dan sudut pemotongan penerima-penderma-H ditetapkan kepada ≥ 160°–180°.(D) Sisa berlabel membentuk interaksi protein-protein HLA-A dengan rakan kongsi masing-masing, menjangkau ≥ 20 ns, diekstrak daripada kompleks HLA-A-H2B dan HLA-A-HMGA1 tiruan.Struktur protein mewakili struktur purata 100 ns MDS.(E) Interaksi antara kompleks HLA-A-H2B dan HLA-A-HMGA1 berbanding interaksi yang dikesan oleh simulasi H2B-HLA lebih 100 ns berdasarkan tapak interaksi K atau S antara kedua-dua peptida.Kompleks /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Nilai ambang untuk penilaian pautan silang ditetapkan kepada 3.0, dan interaksi khusus daripada MDS yang mengambil ≥ 10 ns telah diambil kira.Struktur protein divisualisasikan menggunakan pakej BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, Amerika Syarikat) dan Persekitaran Operasi Molekul (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Kestabilan molekul HLA-A dari semasa ke semasa (sisihan piawai; RMSD atau sisihan piawai; RMSF) menunjukkan bahawa kehadiran protein H2B atau HMGA1 dalam kompleks menstabilkan HLA-A (Rajah 8B, Rajah S5).Protein HMGA1 mengikat ketat ke tapak B2M HLA-A, mendorong kestabilan asid amino HLA-A dalam kompleks HLA-A-HMGA1 atau H2B-HLA-A-HMGA1 (Rajah 8B, Rajah S5).khususnya, sisa HLA ~60-90 dan ~180-210 didapati kurang fleksibel dengan kehadiran H2B (Rajah 8B).H2B dan HMGA1 menunjukkan pengikatan yang lebih baik kepada HLA-A dalam kompleks H2B-HLA-A-HMGA1 berbanding dengan pengikatan HLA-A kepada H2B atau HMGA1 sahaja (Rajah 8C, D; Jadual S5).Sisa yang terlibat dalam ikatan hidrogen (MD dimodelkan penghunian tinggi ≥ 10 ns) bertepatan dengan tapak interaksi CLMS (sisa K atau S) dalam kompleks, menunjukkan bahawa interaksi yang dikenal pasti oleh CLMS adalah sangat dipercayai.Kebolehpercayaan (Rajah 8E).Dalam pemodelan CLMS dan MD, sisa HLA-A antara kira-kira 190-210 dan kira-kira 200-220 asid amino didapati masing-masing mengikat H2B dan HMGA1 (Rajah 8E).
Interaksi protein-protein membentuk rangkaian struktur dinamik yang menjadi pengantara komunikasi intrasel sebagai tindak balas kepada rangsangan tertentu.Oleh kerana banyak pendekatan proteomik mengesan perubahan dalam tahap keadaan mantap keseluruhan protein, dinamik interaksi protein-protein memerlukan alat tambahan untuk menangkap antara muka yang mengikat, dan CLMS ialah salah satu alat tersebut.Sistem isyarat interferon ialah rangkaian sitokin yang membolehkan sel bertindak balas kepada pelbagai isyarat patologi patogenik dan intrinsik persekitaran, yang memuncak dalam induksi subset protein yang boleh diinduksi interferon.Kami menggunakan CLMS untuk menentukan sama ada interaksi protein-protein baru boleh dikenal pasti di kalangan panel protein yang disebabkan oleh interferon.Analisis pautan silang protein global dalam model sel Flo-1 yang responsif interferon digunakan untuk menangkap kompleks protein.Pengekstrakan peptida tryptik daripada sel tidak berkait silang dan berkait silang membolehkan pengiraan peptida, pengayaan laluan dan pengedaran panjang peptida dengan keamatan LFQ yang ditentukan.Protein yang boleh diinduksi interferon kanonik telah dikenalpasti sebagai kawalan dalaman yang positif, manakala tambahan intermolekul dan intramolekul silang silang protein yang boleh diinduksi interferon kanonik seperti MX1, UP18, OAS3 dan STAT1 diperhatikan.Pelbagai ciri struktur dan interaksi dalam kawasan berfungsi telah disiasat.
Interaksi antara HLA-A, MDN1 dan H2B dikesan oleh immunoblotting dalam sel Flo-1 dan A549 yang dirawat dan tidak dirawat dengan IFNα.Keputusan kami menyerlahkan bahawa kompleks HLA-A dengan H2B dalam cara yang bergantung kepada IFNα.Kerja kami mewakili jalan yang menarik untuk penerokaan lanjut mengenai penyetempatan bersama kedua-dua kompleks ini.Ia juga menarik untuk mengembangkan pendekatan CLMS kepada panel garisan sel untuk mengenal pasti interaksi protein pengantara interferon bebas jenis sel.Akhirnya, kami menggunakan pemodelan MD sebagai pendekatan alternatif untuk memahami dinamik konformasi protein yang terlibat dalam kompleks H2BFS-HLA-A-HMGA1, yang menjejaki perbincangan silang intramolekul dan intermolekul.Kesimpulan daripada data CLMS mencadangkan kemungkinan konformasi berbeza bagi protein H2BFS, HLA-A, dan HMGA1.Kemungkinan konformasi yang berbeza antara kompleks protein dok ini mendedahkan beberapa interaksi yang serupa dengan yang diperhatikan dalam dataset CLMS.Salah satu kekuatan utama kaedah kami ialah ia membolehkan pengenalpastian mudah untuk berinteraksi dengan gen yang sangat polimorfik seperti HLA, jadi ia akan menjadi menarik untuk mengkaji interaksi protein khusus haplotype HLA yang sebaliknya sukar untuk dikaji.Diambil bersama, data kami menunjukkan bahawa CLMS boleh digunakan untuk mengembangkan pemahaman kami tentang rangkaian isyarat yang disebabkan oleh interferon dan menyediakan asas untuk mengkaji sistem antara sel yang lebih kompleks dalam persekitaran mikro tumor.
Sel Flo-1 diperoleh daripada ATCC dan dikekalkan dalam DMEM (Gibco) ditambah dengan 1% penisilin/streptomisin (Invitrogen), 10% serum lembu janin (Gibco) dan disimpan pada suhu 37°C dan 5% CO2.Pengeraman.Sel-sel telah berkembang kepada 70-80% pertemuan sebelum dirawat dengan IFNα14 (dihasilkan oleh Edinburgh Protein Production Facility).Semua bahan kimia dan reagen lain telah dibeli daripada Sigma Aldrich melainkan dinyatakan sebaliknya.
Sel Flo-1 telah dibiakkan dalam plat 6-telaga dan keesokan harinya sel-sel itu dirawat dengan 10 ng/ml IFNα14 selama 24 jam kepada kira-kira 80% pertemuan.Sel telah dibasuh tiga kali dengan PBS dan diikat dengan DSS (Thermo Fisher Scientific) yang baru disediakan (dilarutkan dalam DMSO) dalam PBS selama 5 minit pada 37° C. hingga kepekatan akhir 0.5 mM.Tindak balas silang silang DSS digantikan dengan PBS dan sisa DSS dipadamkan dengan menambahkan 20 mM Tris (pH 8.0) dalam PBS selama 15 minit pada 37 ° C.Sel-sel dikumpulkan dengan mengikis dan dikumpulkan dalam tiub pengikat rendah (Axygen).
Pelet sel telah dilisiskan dengan 300 µl penimbal lisis urea (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) selama 30 minit pada suhu bilik dengan goncangan sekali-sekala.Semua langkah sentrifugasi dilakukan pada 14,000 xg pada 8°C.Sentrifuge lysate selama 10 minit dan pindahkan supernatan ke tiub baru.Baki zarah jernih telah dilarutkan dalam 150 μl penimbal lisis kedua (2 M urea, 2% (w/v) SDS (natrium dodesil sulfat)) selama 30 minit atau lebih sehingga larutan akueus homogen diperolehi.Lisat diempar selama 20 minit dan supernatan dicampur dengan lisat yang diperolehi pada langkah sebelumnya.Kepekatan protein dinilai menggunakan ujian Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) mengikut arahan pengilang untuk prosedur plat mikro.Sampel telah dibekukan dengan cepat dalam nitrogen cecair dan disimpan pada -80°C.
Kira-kira 100 μg protein berkait silang larut telah diproses menggunakan protokol penyediaan sampel penapisan (FASP) yang diubah suai seperti yang diterangkan oleh Wisniewski et al.69 Secara ringkasnya, protein disambung silang dengan 200 µl penimbal urea (8 M urea dalam 0.1 M Tris, pH 8.5), divorteks dan dibelah dua.Semua langkah sentrifugasi dilakukan pada 14,000 xg pada 25°C.Separuh pertama lisat protein berkait silang dipindahkan ke peranti penapis emparan Microcon 10 kDa yang dilengkapi dengan membran Ultracel-10 (Merck), diikuti dengan sentrifugasi pada penapis selama 25 minit.Kemudian tambah separuh kedua protein ke penapis dan ulangi langkah yang sama.Pemulihan protein dilakukan dengan menambahkan 100 μl 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) dalam penimbal urea.Pemulihan dikacau pada thermomixer pada 600 rpm selama 30 minit pada 37°C.Di samping itu, lajur telah disentrifugasi dan protein berkait silang yang dikurangkan telah dialkilasi menggunakan 100 μl 50 mM iodoacetamide dalam penimbal urea.Tindak balas alkilasi dijalankan pada suhu bilik selama 20 minit dalam keadaan gelap.Putar lajur, basuh dinding lajur 3 kali dengan 100 µl penimbal urea, dan kemudian sentrifuge.Operasi yang sama dilakukan 3 kali menggunakan 100 μl 100 mM ammonium bikarbonat.Sebelum trypsinization, gantikan tiub pengumpulan dengan yang baru.Tambah penimbal pencernaan yang mengandungi 50 mM ammonium bikarbonat dan 1 µl tripsin yang dicairkan dalam penimbal trypsin (Promega).Nisbah trypsin kepada protein dikekalkan pada kira-kira 1:33, dan tindak balas pencernaan diinkubasi semalaman pada suhu 37° C. dalam ruang lembap.Peptida bersilang telah dielusi daripada penapis dengan sentrifugasi selama 25 minit.Pemulihan peptida telah dipertingkatkan dengan menambahkan 50 μl 0.5 M NaCl ke dalam penapis, diikuti dengan sentrifugasi selama 25 minit.
Lajur Putaran Mikro C18 (Harvard Apparatus) digunakan untuk menyah garam peptida tryptik silang silang mengikut protokol yang diterangkan oleh Bouchal et al.70 dengan pengubahsuaian kecil.Secara ringkas, lajur putaran C18 telah diaktifkan dengan tiga cucian 0.1% asid formik (FA) dalam asetonitril (AcN) (Merck) dan dua cucian 0.1% FA.Lajur telah terhidrat dengan 0.1% FA selama 15 minit.Muatkan sampel ke dalam lajur putaran dan basuh 3 kali dengan FA 0.1%.Peptida desalted telah dielusi secara berurutan dengan kecerunan berperingkat menggunakan 50%, 80% dan 100% AcN dalam 0.1% FA.Sampel telah dikeringkan dalam penumpu SpeedVac Plus (Eppendorf) sehingga cecair sisa hilang sepenuhnya.Peptida yang dicairkan telah dibubarkan dalam 100 μl asid trifluoroacetic 0.08% dalam 2.5% AcN dan kepekatannya diukur pada NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Kira-kira 1 μg peptida bersilang setiap sampel disuntik ke dalam sistem LC-MS/MS.
Peptida berkait silang telah dipisahkan pada sistem UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) yang disambungkan kepada spektrometer jisim Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptida berkait silang dikumpulkan pada ID 300 µm, lajur tangkapan µ-pra-lajur C18 5 mm panjang yang dibungkus dengan sorben C18 PepMap100 dan sorben PepMap 5 µm (Thermo Scientific).Muatkan set aliran pam pada 5 µl/min 0.08% asid trifluoroacetic yang dilarutkan dalam 2.5% AcN.Peptida bersilang dipisahkan pada lajur silika bercantum analitik dengan diameter dalam 75 μm dan panjang 150 mm, diisi dengan sorben PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Fasa mudah alih A dan B terdiri daripada 0.1% FA dalam air dan 0.1% FA dalam asetonitril, masing-masing.Kecerunan bermula pada 2.5% B dan meningkat secara linear kepada 40% B dalam tempoh 90 minit, kemudian kepada 90% B dalam tempoh 2 minit seterusnya.Komposisi fasa mudah alih dikekalkan pada 90% B selama 10 minit dan kemudian menurun secara linear kepada 2.5% B selama 2 minit.Lajur telah diseimbangkan pada 2.5% B selama 8 minit sebelum kitaran seterusnya.Peptida berkait silang yang dielusi daripada lajur analitik telah diionkan dalam sumber pengionan nanoelectrospray (NSI) dan disuntik ke dalam spektrometer jisim Exploris 480 (Thermo Scientific).
Spektrometer jisim Orbitrap Exploris 480 beroperasi dalam mod korelasi data positif.Imbasan penuh dilakukan dalam mod bahagian pada resolusi 120,000 dengan tetapan julat dari m/z 350 Th hingga m/z 2000 Th.Sasaran AGC yang dinormalkan ditetapkan pada 300% dengan masa input maksimum 50ms.Pengesanan puncak monoisotopik telah ditubuhkan untuk peptida.Parameter kelonggaran kekangan ditetapkan kepada benar jika terlalu sedikit prekursor ditemui.Kekuatan ionik minimum prekursor ditetapkan kepada 5.0e3 dan keadaan cas prekursor sehingga +8 telah dimasukkan dalam eksperimen.
Masa kitaran antara imbasan utama dalam mod korelasi data ditetapkan kepada 2.5 saat.Pengecualian jisim dinamik ditetapkan kepada 20 saat selepas pemecahan pertama ion prekursor.Tetingkap pengasingan prekursor ditetapkan kepada 2 Th.Jenis tenaga perlanggaran normal dengan mod tenaga perlanggaran tetap telah dipilih dalam imbasan MS/MS yang bergantung kepada data.Tenaga perlanggaran ditetapkan kepada 30%.Resolusi Orbitrap ditetapkan kepada 15,000 dan sasaran AGC kepada 100%.Masa suntikan maksimum tersuai ditetapkan kepada 60 milisaat.
Sebelum menjejak rangkaian protein-protein dalam sampel bersilang, kami memproses fail mentah menggunakan pakej MaxQuant (versi 1.6.12.0)26,27 untuk mengenal pasti peptida/protein yang boleh dikesan dalam sampel.Di samping itu, analisis proteomik yang serupa telah dilakukan pada sampel Flo-1 yang tidak bersilang yang dirawat dan tidak dirawat dengan IFNα.Data MS/MS telah dicari dalam pangkalan data manusia UniProt (www.uniprot.org) (dimuat naik 12 Ogos 2020, mengandungi 75,093 entri) menggunakan enjin carian terbina dalam Andromeda27.Pencarian dilakukan tanpa menunjukkan kekhususan enzim dan pelbagai pengubahsuaian deamidasi (N, Q) dan pengoksidaan (M).Toleransi jisim prekursor ditetapkan pada 20 ppm dan ion produk pada 0.02 Da.Sisihan jisim awal dan maksimum ditetapkan kepada 10 ppm.Jisim maksimum peptida ditetapkan pada 4600 Da dan persamaan urutan ditetapkan antara 7 dan 25 asid amino (aa).Analisis statistik selanjutnya dilakukan menggunakan program Perseus (versi 1.6.10.45).Kandungan protein dikira dengan menormalkan keamatan spektrum protein (keamatan LFQ; kuantifikasi tidak berlabel)27 dan nilai keamatan ditukar kepada Log2.Pengelompokan hierarki protein yang dikenal pasti oleh keamatan peptidanya telah dibina menggunakan pakej pheatmap (v1.0.12) dalam R (v 4.1.2).Analisis pengayaan laluan dilakukan menggunakan pangkalan data laluan Reactome untuk protein yang dirawat IFNα yang lebih daripada empat kali diaktifkan berbanding sampel yang tidak dirawat.
Pengenalpastian pautan silang kimia spesifik lisin (K) atau serina (S) bagi kompleks protein yang dipantau oleh LC-MS/MS dilakukan menggunakan mesin pengenalan spektroskopi (SIM-XL) untuk peptida silang silang (SIM-XL)29.Pertama, kemungkinan interaksi antara gen tandatangan rintangan kerosakan DNA (IRDS) berkaitan interferon (IFN) telah disiasat menggunakan set data protein IRDS yang diterangkan dalam Padariya et al.28.Menyaring semua keadaan dan ulangan keseluruhan UniProt manusia adalah intensif secara pengiraan, jadi keseluruhan pangkalan data UniProt manusia (www.uniprot.org) (muat turun 12 Ogos 2020, mengandungi 75,093 entri) terhadap ulangan yang dirawat IFNα.Salah satu penapis untuk interaksi kepercayaan tinggi.Interaksi berkepentingan tinggi yang diperoleh ini diperluaskan dan diuji dalam semua ulangan dan keadaan.
Dalam SIM-XL, DSS digunakan untuk penyambung silang (XL) dan anjakan berat XL dan anjakan berat pengubahsuaian ditetapkan kepada 138.06 dan 156.07, masing-masing.Tapak tindak balas pemautan silang berikut dipertimbangkan: KK, KS dan KN-TERM, tanpa ion wartawan.Kedua-dua prekursor dan ppm serpihan ditetapkan kepada 20 dan ambang Xrea ditetapkan kepada 0.15.Trypsin dianggap khusus sepenuhnya, dan kaedah pemecahan perangkap C (HCD) bertenaga tinggi telah dilaksanakan.Ambang pengurangan DB dinamik XCorr dan bilangan minimum peptida untuk pengurangan DB dinamik masing-masing ditetapkan kepada 2.5 dan 2.Parameter lain ialah: kebarangkalian monoisotop dan pemotongan kebetulan puncak, minimum 4 sisa AA bagi setiap helai dan caj helai maksimum, dan 3 maksimum pecahan terlepas.Peta 2D yang dicantumkan telah dianalisis dalam (SIM-XL) dan perwakilan grafik xQuest28 digunakan untuk membina peta 2D.Pautan silang protein pada struktur protein disediakan dalam PyMol (Sistem Grafik Molekul PyMOL, versi 2.0 Schrödinger, LLC).
Struktur model protein dicipta menggunakan pelayan Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 menggunakan prinsip pemodelan homologi dan pelaksanaan "Kaedah Markov Tersembunyi".Phyre2 menjana struktur model berdasarkan penjajaran jujukan dengan struktur protein yang diketahui.Untuk protein H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, dan MDN1, struktur templat 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, dan 6i2665 telah digunakan.Di samping itu, struktur AlphaFold71 MX1, UBP18 dan ROBO1 juga dipertimbangkan.Struktur protein telah divisualisasikan menggunakan pakej BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) dan pakej Persekitaran Operasi Molekul (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).