Terima kasih kerana melawat Nature.com.Anda menggunakan versi penyemak imbas dengan sokongan CSS terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami menunjukkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Peluncur menunjukkan tiga artikel setiap slaid.Gunakan butang belakang dan seterusnya untuk bergerak melalui slaid, atau butang pengawal slaid di hujung untuk bergerak melalui setiap slaid.

317 Pembekal tiub gegelung keluli tahan karat

Jadual komposisi kimia bahan keluli tahan karat

SPACA6 ialah protein permukaan yang diekspresikan sperma yang penting untuk gabungan gamet semasa pembiakan seksual mamalia.Walaupun peranan asas ini, fungsi khusus SPACA6 kurang difahami.Kami menjelaskan struktur kristal domain ekstraselular SPACA6 pada resolusi 2.2 Å, mendedahkan protein dua domain yang terdiri daripada berkas empat helai dan β-sandwic seperti Ig yang disambungkan oleh penghubung seakan-akan fleksibel.Struktur ini menyerupai IZUMO1, satu lagi protein berkaitan gabungan gamet, menjadikan SPACA6 dan IZUMO1 ahli pengasas superfamili protein berkaitan persenyawaan yang disebut di sini sebagai superfamili IST.Superfamili IST ditakrifkan secara struktur oleh berkas empat heliks berpintal dan sepasang motif CXXC yang dipautkan disulfida.Carian AlphaFold berasaskan struktur bagi proteom manusia mengenal pasti ahli protein tambahan bagi superfamili ini;terutamanya, kebanyakan protein ini terlibat dalam pelakuran gamet.Struktur SPACA6 dan hubungannya dengan ahli superfamili IST yang lain memberikan pautan yang hilang dalam pengetahuan kami tentang gabungan gamet mamalia.
Setiap kehidupan manusia bermula dengan dua gamet haploid yang berasingan: sperma bapa dan telur ibu.Sperma ini adalah pemenang proses pemilihan yang sengit di mana berjuta-juta sel sperma melalui saluran kemaluan wanita, mengatasi pelbagai halangan1 dan menjalani kapasiti, yang meningkatkan motilitas mereka dan proses komponen permukaan2,3,4.Walaupun sperma dan oosit bertemu antara satu sama lain, proses itu belum berakhir.Oosit dikelilingi oleh lapisan sel kumulus dan penghalang glikoprotein yang dipanggil zona pellucida, di mana sperma mesti melalui untuk memasuki oosit.Spermatozoa menggunakan gabungan molekul lekatan permukaan dan enzim yang berkaitan dengan membran dan dirembes untuk mengatasi halangan akhir ini5.Molekul dan enzim ini terutamanya disimpan dalam membran dalam dan matriks akrosomal dan dikesan apabila membran luar sperma dilisiskan semasa tindak balas akrosom6.Langkah terakhir dalam perjalanan sengit ini ialah peristiwa gabungan sperma-telur, di mana kedua-dua sel menggabungkan membran mereka untuk menjadi organisma diploid tunggal7.Walaupun proses ini adalah terobosan dalam pembiakan manusia, interaksi molekul yang diperlukan kurang difahami.
Sebagai tambahan kepada persenyawaan gamet, kimia gabungan dua dwilapisan lipid telah dikaji secara meluas.Secara amnya, pelakuran membran ialah proses yang tidak menguntungkan secara bertenaga yang memerlukan pemangkin protein untuk menjalani perubahan konformasi struktur yang membawa dua membran lebih rapat, memecahkan kesinambungannya dan menyebabkan pelakuran8,9.Pemangkin protein ini dikenali sebagai fusogens dan telah ditemui dalam sistem gabungan yang tidak terkira banyaknya.Ia diperlukan untuk kemasukan virus ke dalam sel perumah (cth, gp160 dalam HIV-1, lonjakan dalam coronavirus, hemagglutinin dalam virus influenza)10,11,12 plasenta (syncytin)13,14,15 dan gabungan membentuk gamet dalam eukariota bawah ( HAP2/GCS1 dalam tumbuhan, protista dan artropod) 16,17,18,19.Fusogens untuk gamet manusia masih belum ditemui, walaupun beberapa protein telah ditunjukkan sebagai kritikal untuk lampiran dan peleburan gamet.CD9 yang diekspresikan oosit, protein transmembran yang diperlukan untuk gabungan tetikus dan gamet manusia, adalah yang pertama ditemui 21,22,23.Walaupun fungsi tepatnya masih tidak jelas, peranan dalam lekatan, struktur fokus lekatan pada mikrovili telur, dan/atau penyetempatan protein permukaan oosit yang betul nampaknya 24,25,26.Dua protein paling tipikal yang penting untuk pelakuran gamet ialah protein sperma IZUMO127 dan protein oosit JUNO28, dan persatuan bersama mereka merupakan langkah penting dalam pengecaman dan lekatan gamet sebelum pelakuran.Tikus kalah mati Izumo1 jantan dan tikus kalah mati Juno betina adalah steril sepenuhnya, dalam model ini sperma memasuki ruang perivitelline tetapi gamet tidak bercantum.Begitu juga, pertemuan dikurangkan apabila gamet dirawat dengan antibodi anti-IZUMO1 atau JUNO27,29 dalam eksperimen persenyawaan in vitro manusia.
Baru-baru ini, sekumpulan protein ekspresi sperma yang baru ditemui secara fenotip serupa dengan IZUMO1 dan JUNO20,30,31,32,33,34,35 telah ditemui.Protein 6 yang berkaitan dengan membran akrosomal sperma (SPACA6) telah dikenal pasti sebagai penting untuk persenyawaan dalam kajian mutagenesis murine berskala besar.Memasukkan transgen ke dalam gen Spaca6 menghasilkan spermatozoa yang tidak boleh bercampur, walaupun spermatozoa ini menyusup ke ruang perivitelline 36 .Kajian kalah mati berikutnya pada tikus mengesahkan bahawa Spaca6 diperlukan untuk gabungan gamet 30,32 .SPACA6 dinyatakan hampir secara eksklusif dalam testis dan mempunyai corak penyetempatan yang serupa dengan IZUMO1, iaitu dalam intima spermatozoa sebelum tindak balas akrosomal, dan kemudian berhijrah ke kawasan khatulistiwa selepas tindak balas akrosomal 30,32.Homolog Spaca6 wujud dalam pelbagai mamalia dan eukariota lain 30 dan kepentingannya untuk pelakuran gamet manusia telah ditunjukkan melalui perencatan persenyawaan manusia secara in vitro oleh penentangan terhadap SPACA6 30 .Tidak seperti IZUMO1 dan JUNO, butiran struktur, interaksi dan fungsi SPACA6 masih tidak jelas.
Untuk lebih memahami proses asas yang mendasari gabungan sperma dan telur manusia, yang akan membolehkan kami memaklumkan perkembangan masa depan dalam perancangan keluarga dan rawatan kesuburan, kami menjalankan kajian struktur dan biokimia SPACA6.Struktur kristal domain ekstraselular SPACA6 menunjukkan berkas empat heliks (4HB) dan domain seperti immunoglobulin (seperti Ig) yang disambungkan oleh kawasan seakan-akan fleksibel.Seperti yang diramalkan dalam kajian terdahulu, 7, 32, 37 struktur domain SPACA6 adalah serupa dengan IZUMO1 manusia, dan kedua-dua protein berkongsi motif yang luar biasa: 4HB dengan permukaan heliks segi tiga dan sepasang motif CXXC yang berkaitan disulfida.Kami mencadangkan bahawa IZUMO1 dan SPACA6 kini mentakrifkan superfamili protein yang lebih besar dan berkaitan dengan struktur yang dikaitkan dengan gabungan gamet.Menggunakan ciri unik kepada superfamily, kami menjalankan carian menyeluruh untuk proteom manusia struktur AlphaFold, mengenal pasti ahli tambahan superfamily ini, termasuk beberapa ahli yang terlibat dalam gabungan gamet dan/atau persenyawaan.Kini nampaknya terdapat lipatan struktur biasa dan superfamili protein yang dikaitkan dengan gabungan gamet, dan struktur kami menyediakan peta molekul aspek penting mekanisme gabungan gamet manusia ini.
SPACA6 ialah protein transmembran satu laluan dengan satu glycan berkaitan N dan enam ikatan disulfida putatif (Rajah S1a dan S2).Kami menyatakan domain ekstraselular SPACA6 manusia (residu 27-246) dalam sel Drosophila S2 dan membersihkan protein menggunakan pertalian nikel, pertukaran kation dan kromatografi pengecualian saiz (Rajah S1b).Ectodomain SPACA6 yang telah dimurnikan adalah sangat stabil dan homogen.Analisis menggunakan kromatografi pengecualian saiz digabungkan dengan penyerakan cahaya poligon (SEC-MALS) mendedahkan satu puncak dengan berat molekul terkira 26.2 ± 0.5 kDa (Rajah S1c).Ini konsisten dengan saiz ektodomain monomerik SPACA6, menunjukkan bahawa oligomerisasi tidak berlaku semasa penulenan.Selain itu, spektroskopi dichroism (CD) bulat mendedahkan struktur α/β bercampur dengan takat lebur 51.3 °C (Rajah S1d,e).Dekonvolusi spektrum CD mendedahkan 38.6% unsur α-heliks dan 15.8% β-stranded (Rajah S1d).
Ektodomain SPACA6 telah dihablurkan menggunakan pembenihan matriks rawak38 menghasilkan set data dengan resolusi 2.2 Å (Jadual 1 dan Rajah S3).Menggunakan gabungan penggantian molekul berasaskan serpihan dan data berfasa SAD dengan pendedahan bromida untuk penentuan struktur (Jadual 1 dan Rajah S4), model ditapis akhir terdiri daripada residu 27–246.Pada masa struktur ditentukan, tiada struktur eksperimen atau AlphaFold tersedia.Ektodomain SPACA6 berukuran 20 Å × 20 Å × 85 Å, terdiri daripada tujuh heliks dan sembilan helai β, dan mempunyai lipatan tertier memanjang yang distabilkan oleh enam ikatan disulfida (Rajah 1a, b).Ketumpatan elektron yang lemah pada hujung rantai sisi Asn243 menunjukkan bahawa sisa ini adalah glikosilasi berkait-N.Struktur ini terdiri daripada dua domain: satu bundle empat heliks terminal-N (4HB) dan domain seperti Ig terminal-C dengan kawasan engsel perantaraan di antara mereka (Rajah 1c).
a Struktur domain ekstraselular SPACA6.Gambar rajah jalur domain ekstraselular SPACA6, warna rantai dari N ke C-terminus daripada biru tua kepada merah gelap.Sistein yang terlibat dalam ikatan disulfida diserlahkan dalam magenta.b Topologi domain ekstraselular SPACA6.Gunakan skema warna yang sama seperti dalam Rajah 1a.c domain ekstraselular SPACA6.Carta jalur domain 4HB, engsel dan seperti Ig masing-masing berwarna oren, hijau dan biru.Lapisan tidak dilukis mengikut skala.
Domain 4HB SPACA6 merangkumi empat heliks utama (heliks 1–4), yang disusun dalam bentuk heliks heliks (Rajah 2a), berselang seli antara interaksi antiselari dan selari (Rajah 2b).Heliks pusingan tunggal kecil tambahan (heliks 1′) diletakkan berserenjang dengan berkas, membentuk segi tiga dengan heliks 1 dan 2. Segitiga ini cacat sedikit dalam pembungkusan berpintal heliks bagi pembungkusan heliks 3 dan 4 yang agak padat ( Rajah 2a).
Carta jalur terminal 4HB N.b Pandangan atas berkas empat heliks, setiap heliks diserlahkan dengan warna biru tua di terminal-N dan merah gelap di terminal-C.c Gambar rajah roda lingkaran atas ke bawah untuk 4HB, dengan setiap sisa ditunjukkan sebagai bulatan yang dilabelkan dengan kod asid amino satu huruf;hanya empat asid amino di bahagian atas roda bernombor.Sisa bukan kutub diwarnakan kuning, sisa tak bercas polar diwarnakan hijau, sisa bercas positif diwarnakan biru, dan sisa bercas negatif diwarnakan merah.d Muka segi tiga domain 4HB, dengan 4HB dalam oren dan engsel dalam warna hijau.Kedua-dua inset menunjukkan ikatan disulfida berbentuk rod.
4HB tertumpu pada teras hidrofobik dalaman yang terdiri terutamanya daripada sisa alifatik dan aromatik (Rajah 2c).Inti mengandungi ikatan disulfida antara Cys41 dan Cys55 yang menghubungkan heliks 1 dan 2 bersama-sama dalam segi tiga terangkat atas (Rajah 2d).Dua ikatan disulfida tambahan telah terbentuk di antara motif CXXC dalam Helix 1′ dan satu lagi motif CXXC yang ditemui pada hujung β-jepit rambut di kawasan engsel (Rajah 2d).Sisa arginin konservatif dengan fungsi yang tidak diketahui (Arg37) terletak di dalam segitiga berongga yang dibentuk oleh heliks 1′, 1, dan 2. Atom karbon alifatik Cβ, Cγ, dan Cδ Arg37 berinteraksi dengan teras hidrofobik, dan kumpulan guanidinnya bergerak secara kitaran antara heliks 1′ dan 1 melalui interaksi antara tulang belakang Thr32 dan rantai sisi (Rajah S5a, b).Tyr34 memanjang ke dalam rongga meninggalkan dua rongga kecil di mana Arg37 boleh berinteraksi dengan pelarut.
Domain β-sandwic seperti Ig ialah superfamili besar protein yang berkongsi ciri umum dua atau lebih helaian β amphipathic berbilang untaian yang berinteraksi melalui teras hidrofobik 39. Domain seperti Ig terminal-C bagi SPACA6 mempunyai corak yang sama dan terdiri daripada dua lapisan (Rajah S6a).Helaian 1 ialah helaian β empat helai (helai D, F, H, dan I) di mana helai F, H, dan I membentuk susunan anti selari, dan helai I dan D mengambil interaksi selari.Jadual 2 ialah helaian beta beruntai dua anti selari kecil (helai E dan G).Ikatan disulfida dalaman diperhatikan di antara terminal-C rantai E dan pusat rantai H (Cys170-Cys226) (Rajah S6b).Ikatan disulfida ini serupa dengan ikatan disulfida dalam domain β-sandwic immunoglobulin40,41.
Helaian β empat helai berpusing sepanjang keseluruhan panjangnya, membentuk tepi tidak simetri yang berbeza dalam bentuk dan elektrostatik.Tepi yang lebih nipis ialah permukaan persekitaran hidrofobik rata yang menonjol berbanding dengan baki permukaan yang tidak rata dan pelbagai elektrostatik dalam SPACA6 (Rajah S6b, c).Halo kumpulan karbonil/amino tulang belakang terdedah dan rantai sisi kutub mengelilingi permukaan hidrofobik (Rajah S6c).Margin yang lebih luas diliputi oleh segmen heliks bertutup yang menyekat bahagian terminal N teras hidrofobik dan membentuk tiga ikatan hidrogen dengan kumpulan kutub terbuka tulang belakang rantai F (Rajah S6d).Bahagian C-terminal pinggir ini membentuk poket besar dengan teras hidrofobik yang terdedah sebahagiannya.Poket itu dikelilingi oleh caj positif disebabkan oleh tiga set sisa arginin berganda (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 dan Arg212-Arg214) dan histidin pusat (His220) (Rajah S6e).
Rantau engsel ialah segmen pendek antara domain heliks dan domain seperti Ig, yang terdiri daripada satu lapisan β tiga helai antiselari (helai A, B dan C), heliks 310 kecil, dan beberapa segmen heliks rawak panjang.(Gamb. S7).Rangkaian hubungan kovalen dan elektrostatik di kawasan engsel kelihatan menstabilkan orientasi antara 4HB dan domain seperti Ig.Rangkaian boleh dibahagikan kepada tiga bahagian.Bahagian pertama termasuk dua motif CXXC (27CXXC30 dan 139CXXC142) yang membentuk sepasang ikatan disulfida antara β-jepit rambut dalam engsel dan heliks 1′ dalam 4HB.Bahagian kedua termasuk interaksi elektrostatik antara domain seperti Ig dan engsel.Glu132 dalam engsel membentuk jambatan garam dengan Arg233 dalam domain seperti Ig dan Arg135 dalam engsel.Bahagian ketiga termasuk ikatan kovalen antara domain seperti Ig dan kawasan engsel.Dua ikatan disulfida (Cys124-Cys147 dan Cys128-Cys153) menyambungkan gelung engsel kepada penyambung yang distabilkan oleh interaksi elektrostatik antara Gln131 dan kumpulan berfungsi tulang belakang, membenarkan akses kepada domain seperti Ig yang pertama.rantai.
Struktur ektodomain SPACA6 dan struktur individu domain seperti 4HB dan Ig digunakan untuk mencari rekod yang serupa secara struktur dalam pangkalan data protein 42 .Kami mengenal pasti padanan dengan skor Dali Z yang tinggi, sisihan piawai yang kecil dan skor LALI yang besar (yang terakhir ialah bilangan sisa yang setara secara struktur).Walaupun 10 hits pertama daripada carian ectodomain penuh (Jadual S1) mempunyai skor Z yang boleh diterima >842, carian untuk domain 4HB atau Ig sahaja menunjukkan bahawa kebanyakan hits ini sepadan dengan β-sandwic sahaja.lipatan di mana-mana terdapat dalam banyak protein.Ketiga-tiga carian dalam Dali hanya mengembalikan satu hasil: IZUMO1.
Telah lama dicadangkan bahawa SPACA6 dan IZUMO1 berkongsi persamaan struktur7,32,37.Walaupun ektodomain kedua-dua protein yang dikaitkan dengan gabungan gamet ini berkongsi hanya 21% identiti jujukan (Rajah S8a), bukti yang kompleks, termasuk corak ikatan disulfida terpelihara dan domain seperti Ig terminal C yang diramalkan dalam SPACA6, membenarkan percubaan awal untuk membina model homologi A dan tetikus SPACA6 menggunakan IZUMO1 sebagai templat37.Struktur kami mengesahkan ramalan ini dan menunjukkan tahap persamaan sebenar.Malah, struktur SPACA6 dan IZUMO137,43,44 berkongsi seni bina dua domain yang sama (Rajah S8b) dengan domain β-sandwic 4HB dan Ig yang serupa yang disambungkan oleh kawasan engsel (Rajah S8c).
IZUMO1 dan SPACA6 4HB mempunyai perbezaan biasa daripada berkas lingkaran konvensional.4HBs biasa, seperti yang terdapat dalam kompleks protein SNARE yang terlibat dalam pelakuran endosom 45,46, mempunyai heliks jarak sekata mengekalkan kelengkungan malar di sekeliling paksi pusat 47. Sebaliknya, domain heliks dalam kedua-dua IZUMO1 dan SPACA6 telah diherotkan, dengan kelengkungan berubah-ubah dan pembungkusan tidak sekata (Rajah S8d).Pusingan, mungkin disebabkan oleh segi tiga yang dibentuk oleh heliks 1′, 1 dan 2, dikekalkan dalam IZUMO1 dan SPACA6 dan distabilkan oleh motif CXXC yang sama pada heliks 1′.Walau bagaimanapun, ikatan disulfida tambahan yang terdapat dalam SPACA6 (Cys41 dan Cys55 menghubungkan heliks 1 dan 2 secara kovalen di atas) menghasilkan puncak yang lebih tajam pada puncak segi tiga, menjadikan SPACA6 lebih berpintal daripada IZUMO1, dengan segi tiga rongga yang lebih jelas.Di samping itu, IZUMO1 tidak mempunyai Arg37 yang diperhatikan di tengah-tengah rongga ini dalam SPACA6.Sebaliknya, IZUMO1 mempunyai teras hidrofobik yang lebih tipikal bagi sisa alifatik dan aromatik.
IZUMO1 mempunyai domain seperti Ig yang terdiri daripada β-helaian dua lembar dan lima lembar43.Lembar tambahan dalam IZUMO1 menggantikan gegelung dalam SPACA6, yang berinteraksi dengan helai F untuk mengehadkan ikatan hidrogen tulang belakang dalam helai.Titik perbandingan yang menarik ialah caj permukaan yang diramalkan bagi domain seperti Ig bagi kedua-dua protein.Permukaan IZUMO1 lebih bercas negatif daripada permukaan SPACA6.Caj tambahan terletak berhampiran terminal C yang menghadap membran sperma.Dalam SPACA6, kawasan yang sama adalah lebih neutral atau bercas positif (Rajah S8e).Sebagai contoh, permukaan hidrofobik (tepi yang lebih nipis) dan lubang bercas positif (tepi yang lebih luas) dalam SPACA6 dicas negatif dalam IZUMO1.
Walaupun hubungan dan elemen struktur sekunder antara IZUMO1 dan SPACA6 dipelihara dengan baik, penjajaran struktur domain seperti Ig menunjukkan bahawa kedua-dua domain berbeza dalam orientasi umum mereka berbanding satu sama lain (Rajah S9).Ikatan lingkaran IZUMO1 melengkung mengelilingi β-sandwic, menghasilkan bentuk "buomerang" yang diterangkan sebelum ini pada kira-kira 50° dari paksi tengah.Sebaliknya, rasuk heliks dalam SPACA6 dicondongkan kira-kira 10° ke arah yang bertentangan.Perbezaan dalam orientasi ini mungkin disebabkan oleh perbezaan di kawasan engsel.Pada peringkat jujukan primer, IZUMO1 dan SPACA6 berkongsi sedikit persamaan jujukan pada engsel, kecuali sisa sistein, glisin dan asid aspartik.Akibatnya, ikatan hidrogen dan rangkaian elektrostatik adalah berbeza sama sekali.Elemen struktur sekunder lembaran β dikongsi oleh IZUMO1 dan SPACA6, walaupun rantai dalam IZUMO1 lebih panjang dan heliks 310 (helix 5) adalah unik kepada SPACA6.Perbezaan ini menghasilkan orientasi domain yang berbeza untuk dua protein yang serupa.
Carian pelayan Dali kami mendedahkan bahawa SPACA6 dan IZUMO1 adalah satu-satunya dua struktur yang ditentukan secara eksperimen yang disimpan dalam pangkalan data protein yang mempunyai lipatan 4HB tertentu ini (Jadual S1).Baru-baru ini, DeepMind (Alphabet/Google) telah membangunkan AlphaFold, sistem berasaskan rangkaian saraf yang boleh meramalkan struktur 3D protein daripada jujukan primer48 dengan tepat.Tidak lama selepas kami menyelesaikan struktur SPACA6, pangkalan data AlphaFold telah dikeluarkan, menyediakan model struktur ramalan yang meliputi 98.5% daripada semua protein dalam proteome manusia48,49.Menggunakan struktur SPACA6 kami yang diselesaikan sebagai model carian, carian homologi struktur untuk model dalam proteome manusia AlphaFold mengenal pasti calon yang mungkin mempunyai persamaan struktur dengan SPACA6 dan IZUMO1.Memandangkan ketepatan AlphaFold yang luar biasa dalam meramalkan SPACA6 (Rajah S10a)—terutama ektodomain 1.1 Å rms berbanding dengan struktur diselesaikan kami (Rajah S10b)—kami boleh yakin bahawa padanan SPACA6 yang dikenal pasti berkemungkinan tepat.
Sebelum ini, PSI-BLAST mencari kluster IZUMO1 dengan tiga protein lain yang berkaitan dengan sperma: IZUMO2, IZUMO3 dan IZUMO450.AlphaFold meramalkan bahawa protein keluarga IZUMO ini melipat ke dalam domain 4HB dengan corak ikatan disulfida yang sama seperti IZUMO1 (Rajah 3a dan S11), walaupun mereka tidak mempunyai domain seperti Ig.Adalah dihipotesiskan bahawa IZUMO2 dan IZUMO3 adalah protein membran satu sisi yang serupa dengan IZUMO1, manakala IZUMO4 nampaknya dirembeskan.Fungsi protein IZUMO 2, 3, dan 4 dalam gabungan gamet belum ditentukan.IZUMO3 diketahui memainkan peranan dalam biogenesis akrosom semasa perkembangan spermatozoa51, dan protein IZUMO membentuk kompleks50.Pemuliharaan protein IZUMO dalam mamalia, reptilia, dan amfibia menunjukkan bahawa fungsi potensi mereka adalah konsisten dengan protein berkaitan gamete-fusion lain yang diketahui, seperti DCST1/2, SOF1, dan FIMP.
Gambar rajah seni bina domain keluarga super IST, dengan domain 4HB, engsel dan seperti Ig diserlahkan dalam oren, hijau dan biru, masing-masing.IZUMO4 mempunyai kawasan terminal C unik yang kelihatan hitam.Ikatan disulfida yang disahkan dan diduga ditunjukkan oleh garis pepejal dan garis putus-putus, masing-masing.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-FEM95) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) dipaparkan dalam julat warna yang sama seperti panel A. Ikatan disulfida ditunjukkan dalam magenta.Heliks transmembran TMEM95, IZUMO2 dan IZUMO3 tidak ditunjukkan.
Tidak seperti protein IZUMO, protein SPACA lain (iaitu, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 dan SPACA9) dianggap berbeza dari segi struktur daripada SPACA6 (Rajah S12).Hanya SPACA9 mempunyai 4HB, tetapi ia tidak dijangka mempunyai orientasi selari-anti-selari yang sama atau ikatan disulfida yang sama seperti SPACA6.Hanya SPACA1 yang mempunyai domain seperti Ig yang serupa.AlphaFold meramalkan bahawa SPACA3, SPACA4 dan SPACA5 mempunyai struktur yang sama sekali berbeza daripada SPACA6.Menariknya, SPACA4 juga diketahui memainkan peranan dalam persenyawaan, tetapi pada tahap yang lebih besar daripada SPACA6, sebaliknya memudahkan interaksi antara sperma dan zona oosit pellucida52.
Carian AlphaFold kami menemui padanan lain untuk IZUMO1 dan SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, protein transmembran khusus sperma tunggal, menjadikan tikus jantan tidak subur apabila dibuang 32,33.Spermatozoa yang tidak mempunyai TMEM95 mempunyai morfologi normal, motilitas, dan keupayaan untuk menembusi zona pelusida dan mengikat membran telur, tetapi tidak dapat bersatu dengan membran oosit.Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa TMEM95 berkongsi persamaan struktur dengan IZUMO133.Malah, model AlphaFold mengesahkan bahawa TMEM95 ialah 4HB dengan sepasang motif CXXC yang sama seperti IZUMO1 dan SPACA6 dan ikatan disulfida tambahan yang sama antara heliks 1 dan 2 yang terdapat dalam SPACA6 (Rajah 3a dan S11).Walaupun TMEM95 tidak mempunyai domain seperti Ig, ia mempunyai rantau dengan corak ikatan disulfida serupa dengan kawasan engsel SPACA6 dan IZUMO1 (Rajah 3b).Pada masa penerbitan manuskrip ini, pelayan pracetak melaporkan struktur TMEM95, mengesahkan hasil AlphaFold53.TMEM95 sangat serupa dengan SPACA6 dan IZUMO1 dan secara evolusi telah dipelihara dalam amfibia (Rajah 4 dan S13).
Carian PSI-BLAST menggunakan pangkalan data NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP dan SOF1 untuk menentukan kedudukan jujukan ini dalam pokok kehidupan.Jarak antara titik cawangan tidak ditunjukkan mengikut skala.
Persamaan struktur keseluruhan yang ketara antara SPACA6 dan IZUMO1 menunjukkan bahawa mereka mengasaskan ahli superfamili struktur terpelihara yang merangkumi protein TMEM95 dan IZUMO 2, 3, dan 4.ahli yang dikenali: IZUMO1, SPACA6 dan TMEM95.Oleh kerana hanya beberapa ahli yang memiliki domain seperti Ig, ciri superfamili IST ialah domain 4HB, yang mempunyai ciri unik yang sama dengan semua protein ini: 1) Bergelung 4HB dengan heliks yang disusun dalam selang-seli anti-selari/selari (Rajah). . 5a), 2) berkas mempunyai muka segi tiga yang terdiri daripada dua heliks dalam berkas dan heliks menegak ketiga (Rajah kawasan utama (Rajah 5c). Motif CXXC, yang terdapat dalam protein seperti thioredoxin, diketahui berfungsi sebagai sensor redoks 54,55,56 , manakala motif dalam ahli keluarga IST boleh dikaitkan dengan isomerase disulfida protein seperti ERp57 dalam gabungan gamet. Peranan dikaitkan 57,58.
Ahli superfamili IST ditakrifkan oleh tiga ciri ciri domain 4HB: empat helik berselang-seli antara orientasi selari dan antiselari, muka berkas heliks ba-segi tiga dan motif berganda CXXC yang terbentuk antara molekul kecil.) Heliks terminal-N (oren) dan kawasan engsel β-jepit rambut (hijau).
Memandangkan persamaan antara SPACA6 dan IZUMO1, keupayaan bekas untuk mengikat IZUMO1 atau JUNO telah diuji.Interferometri biolayer (BLI) ialah kaedah pengikatan berasaskan kinetik yang sebelum ini telah digunakan untuk mengukur interaksi antara IZUMO1 dan JUNO.Selepas pengeraman sensor berlabel biotin dengan IZUMO1 sebagai umpan dengan kepekatan tinggi analit JUNO, isyarat kuat telah dikesan (Rajah S14a), menunjukkan perubahan yang disebabkan oleh pengikatan dalam ketebalan biobahan yang dilekatkan pada hujung sensor.Isyarat serupa (iaitu, JUNO digandingkan dengan sensor sebagai umpan terhadap analit IZUMO1) (Rajah S14b).Tiada isyarat dikesan apabila SPACA6 digunakan sebagai analit terhadap IZUMO1 terikat sensor atau JUNO terikat sensor (Rajah S14a, b).Ketiadaan isyarat ini menunjukkan bahawa domain ekstraselular SPACA6 tidak berinteraksi dengan domain ekstraselular IZUMO1 atau JUNO.
Oleh kerana ujian BLI adalah berdasarkan biotinilasi sisa lisin bebas pada protein umpan, pengubahsuaian ini boleh menghalang pengikatan jika residu lisin terlibat dalam interaksi.Di samping itu, orientasi pengikatan relatif kepada sensor boleh mewujudkan halangan sterik, jadi ujian tarik-turun konvensional juga dilakukan pada ektodomain SPACA6, IZUMO1 dan JUNO rekombinan.Walaupun begitu, SPACA6 tidak memendakan dengan IZUMO1 yang ditag-Nya atau JUNO yang ditag-Nya (Rajah S14c, d), menunjukkan tiada interaksi yang konsisten dengan yang diperhatikan dalam eksperimen BLI.Sebagai kawalan positif, kami mengesahkan interaksi JUNO dengan berlabel IZUMO1-Nya (Rajah S14e dan S15).
Walaupun persamaan struktur antara SPACA6 dan IZUMO1, ketidakupayaan SPACA6 untuk mengikat JUNO tidaklah mengejutkan.Permukaan IZUMO1 manusia mempunyai lebih daripada 20 residu yang berinteraksi dengan JUNO, termasuk residu dari setiap tiga wilayah (walaupun kebanyakannya terletak di kawasan engsel) (Rajah S14f).Daripada sisa ini, hanya satu yang dipelihara dalam SPACA6 (Glu70).Walaupun banyak penggantian residu mengekalkan sifat biokimia asalnya, residu Arg160 penting dalam IZUMO1 telah digantikan dengan Asp148 bercas negatif dalam SPACA6;kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa mutasi Arg160Glu dalam IZUMO1 hampir sepenuhnya menghapuskan pengikatan kepada JUNO43.Di samping itu, perbezaan dalam orientasi domain antara IZUMO1 dan SPACA6 dengan ketara meningkatkan luas permukaan tapak pengikat JUNO bagi rantau yang setara pada SPACA6 (Rajah S14g).
Walaupun diketahui keperluan SPACA6 untuk gabungan gamet dan persamaannya dengan IZUMO1, SPACA6 nampaknya tidak mempunyai fungsi pengikatan JUNO yang setara.Oleh itu, kami telah berusaha untuk menggabungkan data struktur kami dengan bukti kepentingan yang disediakan oleh biologi evolusi.Penjajaran jujukan homolog SPACA6 menunjukkan pemuliharaan struktur biasa di luar mamalia.Sebagai contoh, sisa sistein terdapat walaupun dalam amfibia yang berkait jauh (Rajah 6a).Menggunakan pelayan ConSurf, data pengekalan penjajaran berbilang jujukan sebanyak 66 jujukan telah dipetakan ke permukaan SPACA6.Jenis analisis ini boleh menunjukkan sisa yang telah dipelihara semasa evolusi protein dan boleh menunjukkan kawasan permukaan mana yang memainkan peranan dalam fungsi.
penjajaran jujukan ektodomain SPACA6 daripada 12 spesies berbeza yang disediakan menggunakan CLUSTAL OMEGA.Menurut analisis ConSurf, kedudukan yang paling konservatif ditandakan dengan warna biru.Sisa sistein diserlahkan dengan warna merah.Sempadan domain dan elemen struktur sekunder ditunjukkan di bahagian atas penjajaran, di mana anak panah menunjukkan helai-β dan gelombang menunjukkan heliks.Pengecam Akses NCBI yang mengandungi jujukan ialah: manusia (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), monyet capuchin (mimik Cebu, XP_017359366), kuda (Equus caballus oxp2_02_02_02_02_01_01_01_01_02_02_02_02_02_02_02_02_02_02_15_02_15_2015_2015_02_02_03_02_01_02_01_02_01_02_01 3 XP_032_034) .), biri-biri (Ovis aries, XP_014955560), gajah (Loxodonta africana, XP_010585293), anjing (Canis lupus familyis, XP_025277208), tetikus (Mus musculus, NP_001156381), syaitan Tascophilus_0301, Tascophilus_06381 ypus, 8) , 61_89 dan Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Penomboran adalah berdasarkan susunan manusia.b Perwakilan permukaan struktur SPACA6 dengan 4HB di bahagian atas dan domain seperti Ig di bahagian bawah, warna berdasarkan anggaran pemuliharaan daripada pelayan ConSurf.Bahagian terpelihara terbaik adalah dalam warna biru, bahagian yang dipelihara sederhana berwarna putih, dan bahagian yang paling tidak dipelihara adalah dalam warna kuning.sistein ungu.Tiga tompok permukaan yang menunjukkan tahap perlindungan yang tinggi ditunjukkan dalam tompok berlabel sisipan 1, 2 dan 3. Kartun 4HB ditunjukkan dalam inset di sebelah kanan atas (skema warna yang sama).
Struktur SPACA6 mempunyai tiga kawasan permukaan yang sangat terpelihara (Rajah 6b).Tampalan 1 menjangkau 4HB dan rantau engsel dan mengandungi dua jambatan disulfida CXXC terpelihara, rangkaian engsel Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Rajah S7), dan tiga sisa aromatik luar terpelihara (Phe31, Tyr73, Phe137)).rim yang lebih luas bagi domain seperti Ig (Rajah S6e), yang mewakili beberapa sisa bercas positif pada permukaan sperma.Menariknya, tampalan ini mengandungi epitope antibodi yang sebelum ini telah ditunjukkan untuk mengganggu fungsi SPACA6 30.Rantau 3 merentangi engsel dan satu sisi domain seperti Ig;rantau ini mengandungi prolin terpelihara (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) dan sisa kutub/bercas yang menghadap ke luar.Yang menghairankan, kebanyakan sisa pada permukaan 4HB sangat berubah-ubah (Rajah 6b), walaupun lipatan itu dipelihara sepanjang homolog SPACA6 (seperti yang ditunjukkan oleh konservatisme teras berkas hidrofobik) dan di luar superfamili IST.
Walaupun ini adalah rantau terkecil dalam SPACA6 dengan unsur struktur sekunder yang paling sedikit boleh dikesan, banyak sisa kawasan engsel (termasuk rantau 3) sangat terpelihara di kalangan homolog SPACA6, yang mungkin menunjukkan bahawa orientasi berkas heliks dan β-sandwic memainkan peranan.sebagai konservatif.Walau bagaimanapun, walaupun terdapat rangkaian ikatan hidrogen dan elektrostatik yang meluas di kawasan engsel SPACA6 dan IZUMO1, bukti fleksibiliti intrinsik dapat dilihat dalam penjajaran pelbagai struktur yang dibenarkan IZUMO137,43,44.Penjajaran domain individu bertindih dengan baik, tetapi orientasi domain relatif antara satu sama lain berbeza dari 50° hingga 70° dari paksi pusat (Rajah S16).Untuk memahami dinamik konformasi SPACA6 dalam larutan, eksperimen SAXS telah dilakukan (Rajah S17a, b).Ab initio pembinaan semula ektodomain SPACA6 mematuhi struktur kristal rod (Rajah S18), walaupun plot Kratky menunjukkan beberapa tahap kelenturan (Rajah S17b).Konformasi ini berbeza dengan IZUMO1, di mana protein tidak terikat menganggap bentuk bumerang dalam kedua-dua kekisi dan dalam larutan43.
Untuk mengenal pasti secara khusus kawasan fleksibel, spektroskopi jisim pertukaran hidrogen-deuterium (H-DXMS) telah dilakukan pada SPACA6 dan dibandingkan dengan data yang diperoleh sebelum ini pada IZUMO143 (Rajah 7a, b).SPACA6 jelas lebih fleksibel daripada IZUMO1, seperti yang ditunjukkan oleh pertukaran deuterium yang lebih tinggi di seluruh struktur selepas pertukaran 100,000 saat.Dalam kedua-dua struktur, bahagian terminal-C kawasan engsel menunjukkan tahap pertukaran yang tinggi, yang mungkin membenarkan putaran terhad domain 4HB dan Ig-seperti relatif antara satu sama lain.Menariknya, bahagian terminal-C engsel SPACA6, yang terdiri daripada sisa 147CDLPLDCP154, ialah rantau 3 yang sangat terpelihara (Rajah 6b), mungkin menunjukkan bahawa fleksibiliti interdomain ialah ciri SPACA6 yang dipelihara secara evolusi.Mengikut analisis fleksibiliti, data leburan terma CD menunjukkan bahawa SPACA6 (Tm = 51.2°C) adalah kurang stabil daripada IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Rajah S1e dan S19).
a imej H-DXMS SPACA6 dan b IZUMO1.Peratusan pertukaran deuterium ditentukan pada titik masa yang dinyatakan.Tahap pertukaran hidrogen-deuterium ditunjukkan dengan warna pada skala kecerunan daripada biru (10%) kepada merah (90%).Kotak hitam mewakili kawasan pertukaran tinggi.Sempadan domain 4HB, engsel dan seperti Ig yang diperhatikan dalam struktur kristal ditunjukkan di atas jujukan utama.Tahap pertukaran Deuterium pada 10 s, 1000 s, dan 100,000 s telah diplot pada carta jalur yang ditindih pada permukaan molekul lutsinar SPACA6 dan IZUMO1.Bahagian struktur dengan paras pertukaran deuterium di bawah 50% berwarna putih.Kawasan yang melebihi 50% pertukaran H-DXMS diwarnakan dalam skala kecerunan.
Penggunaan strategi genetik CRISPR/Cas9 dan gen tetikus kalah mati telah membawa kepada pengenalpastian beberapa faktor penting untuk pengikatan dan percantuman sperma dan telur.Selain daripada interaksi struktur IZUMO1-JUNO dan CD9 yang dicirikan dengan baik, kebanyakan protein yang dikaitkan dengan gabungan gamet kekal secara struktur dan berfungsi secara misteri.Pencirian biofizikal dan struktur SPACA6 adalah satu lagi kepingan teka-teki molekul lekatan/cantuman semasa persenyawaan.
SPACA6 dan ahli superfamili IST yang lain kelihatan sangat terpelihara dalam mamalia serta burung individu, reptilia dan amfibia;malah, adalah dianggap bahawa SPACA6 juga diperlukan untuk persenyawaan dalam ikan zebra 59. Taburan ini adalah serupa dengan protein lain yang berkaitan gabungan gamet yang diketahui seperti DCST134, DCST234, FIMP31 dan SOF132, menunjukkan bahawa faktor-faktor ini adalah kekurangan HAP2 (juga dikenali sebagai GCS1) protein yang bertanggungjawab untuk aktiviti pemangkin banyak protista., tumbuhan dan arthropoda.Protein gabungan yang disenyawakan 60, 61. Walaupun persamaan struktur yang kuat antara SPACA6 dan IZUMO1, kalah mati pengekodan gen salah satu daripada protein ini mengakibatkan ketidaksuburan pada tikus jantan, menunjukkan bahawa fungsi mereka dalam gabungan gamet tidak diduplikasi..Secara lebih luas, tiada satu pun daripada protein sperma yang diketahui diperlukan untuk fasa pelekatan gabungan adalah berlebihan.
Ia masih menjadi persoalan terbuka sama ada SPACA6 (dan ahli superfamili IST yang lain) mengambil bahagian dalam persimpangan antara permainan, membentuk rangkaian intragametik untuk merekrut protein penting ke titik gabungan, atau mungkin bertindak sebagai fusogens yang sukar difahami.Kajian co-imunoprecipitation dalam sel HEK293T mendedahkan interaksi antara IZUMO1 penuh dan SPACA632.Walau bagaimanapun, ectodomain rekombinan kami tidak berinteraksi secara in vitro, menunjukkan bahawa interaksi yang dilihat dalam Noda et al.kedua-duanya dipadamkan dalam binaan (perhatikan ekor sitoplasma IZUMO1, yang telah terbukti tidak perlu untuk persenyawaan62).Sebagai alternatif, IZUMO1 dan/atau SPACA6 mungkin memerlukan persekitaran mengikat khusus yang tidak kami hasilkan semula secara in vitro, seperti konformasi khusus fisiologi atau kompleks molekul yang mengandungi protein lain (yang diketahui atau belum ditemui).Walaupun ectodomain IZUMO1 dipercayai menjadi pengantara perlekatan spermatozoa pada telur dalam ruang perivitelline, tujuan ectodomain SPACA6 tidak jelas.
Struktur SPACA6 mendedahkan beberapa permukaan terpelihara yang mungkin terlibat dalam interaksi protein-protein.Bahagian kawasan engsel yang terpelihara serta-merta bersebelahan dengan motif CXXC (Tampalan 1 yang ditetapkan di atas) mempunyai beberapa sisa aromatik yang menghadap ke luar yang sering dikaitkan dengan interaksi hidrofobik dan tindanan π antara biomolekul.Sisi luas domain seperti Ig (wilayah 2) membentuk alur bercas positif dengan Arg dan residu His yang sangat terpelihara, dan antibodi terhadap rantau ini sebelum ini telah digunakan untuk menyekat gabungan gamet 30 .Antibodi mengiktiraf epitope linear 212RIRPAQLTHRGTFS225, yang mempunyai tiga daripada enam sisa arginin dan His220 yang sangat terpelihara.Tidak jelas sama ada disfungsi itu disebabkan oleh penyumbatan sisa khusus ini atau seluruh rantau.Lokasi jurang ini berhampiran terminal C β-sandwic menunjukkan interaksi cis dengan protein sperma jiran, tetapi tidak dengan protein oosit.Tambahan pula, pengekalan kusut kaya prolin yang sangat fleksibel (tapak 3) dalam engsel mungkin merupakan tapak interaksi protein-protein atau, lebih berkemungkinan, menunjukkan pengekalan fleksibiliti antara kedua-dua domain.Jantina adalah penting untuk peranan SPACA6 yang tidak diketahui.gabungan gamet.
SPACA6 mempunyai sifat protein lekatan antara sel, termasuk β-sandwic seperti Ig.Banyak protein pelekat (cth, kadherin, integrin, adhesin, dan IZUMO1) mempunyai satu atau lebih domain β-sandwic yang memanjangkan protein dari membran sel ke sasaran persekitarannya63,64,65.Domain seperti Ig SPACA6 juga mengandungi motif yang biasa ditemui dalam β-sandwic lekatan dan kohesi: doublet helai selari di hujung β-sandwic, dikenali sebagai pengapit mekanikal66.Adalah dipercayai bahawa motif ini meningkatkan daya tahan terhadap daya ricih, yang berharga untuk protein yang terlibat dalam interaksi antara sel.Walau bagaimanapun, walaupun persamaan ini dengan adhesin, pada masa ini tiada bukti bahawa SPACA6 berinteraksi dengan putih telur.Ectodomain SPACA6 tidak dapat mengikat JUNO, dan sel HEK293T yang mengekspresikan SPACA6, seperti yang ditunjukkan di sini, hampir tidak berinteraksi dengan oosit yang tidak mempunyai zona 32 .Jika SPACA6 mewujudkan ikatan intergametik, interaksi ini mungkin memerlukan pengubahsuaian selepas terjemahan atau penstabilan oleh protein sperma lain.Untuk menyokong hipotesis yang terakhir, spermatozoa kekurangan IZUMO1 terikat pada oosit, menunjukkan bahawa molekul selain IZUMO1 terlibat dalam langkah lekatan gamet 27 .
Banyak protein gabungan virus, selular dan perkembangan mempunyai sifat yang meramalkan fungsinya sebagai fusogen.Contohnya, glikoprotein gabungan virus (kelas I, II dan III) mempunyai peptida atau gelung gabungan hidrofobik pada hujung protein yang dimasukkan ke dalam membran perumah.Peta hidrofilik IZUMO143 dan struktur (ditentukan dan diramalkan) superfamili IST tidak menunjukkan peptida gabungan hidrofobik yang jelas.Oleh itu, jika mana-mana protein dalam superfamili IST berfungsi sebagai fusogens, mereka melakukannya dengan cara yang berbeza daripada contoh lain yang diketahui.
Kesimpulannya, fungsi ahli-ahli superfamili IST protein yang dikaitkan dengan gabungan gamet kekal sebagai misteri yang menggoda.Molekul rekombinan SPACA6 kami yang dicirikan dan struktur diselesaikannya akan memberikan gambaran tentang hubungan antara struktur yang dikongsi ini dan peranannya dalam lampiran dan gabungan gamet.
Urutan DNA yang sepadan dengan ectodomain SPACA6 manusia yang diramalkan (nombor penyertaan NCBI NP_001303901.1; residu 27-246) telah dioptimumkan kodon untuk ekspresi dalam sel Drosophila melanogaster S2 dan disintesis sebagai serpihan gen dengan pengekodan urutan Kozak (Eurofins Genomics)., isyarat rembesan BiP dan hujung 5' dan 3' yang sepadan untuk pengklonan bebas ligation gen ini ke dalam vektor ekspresi pMT berdasarkan promoter metallothionein yang diubah suai untuk pemilihan dengan puromycin (pMT-puro).Vektor pMT-puro mengekod tapak pembelahan trombin diikuti dengan tag terminal C 10x-His (Rajah S2).
Transfeksi stabil vektor SPACA6 pMT-puro ke dalam sel D. melanogaster S2 (Gibco) dilakukan sama seperti protokol yang digunakan untuk IZUMO1 dan JUNO43.Sel S2 telah dicairkan dan ditanam dalam medium Schneider (Gibco) ditambah dengan kepekatan akhir 10% (v/v) serum anak lembu janin yang tidak diaktifkan haba (Gibco) dan 1X antibiotik antimikotik (Gibco).Sel laluan awal (3.0 x 106 sel) disalut dalam telaga individu plat 6 telaga (Corning).Selepas 24 jam pengeraman pada 27 ° C, sel telah ditransfeksi dengan campuran 2 mg vektor SPACA6 pMT-puro dan reagen pemindahan Effectene (Qiagen) mengikut protokol pengeluar.Sel yang ditransmisikan diinkubasi selama 72 jam dan kemudian dituai dengan 6 mg/ml puromycin.Sel-sel kemudiannya diasingkan daripada medium Schneider yang lengkap dan diletakkan dalam medium Insect-XPRESS bebas serum (Lonza) untuk pengeluaran protein berskala besar.Satu kumpulan 1 L kultur sel S2 telah ditanam kepada 8–10 × 106 ml-1 sel dalam kelalang Erlenmeyer polipropilena rata berventilasi 2 L dan kemudian disterilkan dengan kepekatan akhir 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) dan ditapis steril.teraruh.Kultur teraruh diinkubasi pada 27° C. pada 120 rpm selama empat hari.
Medium berhawa dingin yang mengandungi SPACA6 telah diasingkan melalui sentrifugasi pada 5660×g pada 4°C diikuti dengan sistem penapisan aliran tangensi Centramate (Pall Corp) dengan membran MWCO 10 kDa.Sapukan medium pekat yang mengandungi SPACA6 pada lajur resin agarose (Qiagen) 2 ml Ni-NTA (Qiagen).Resin Ni-NTA telah dibasuh dengan 10 isipadu lajur (CV) penimbal A dan kemudian 1 CV penimbal A ditambah untuk memberikan kepekatan imidazol akhir 50 mM.SPACA6 telah dicairkan dengan 10 ml penimbal A ditambah dengan imidazole kepada kepekatan akhir 500 mM.Trombin kelas sekatan (Millipore Sigma) ditambah terus ke tiub dialisis (MWCO 12-14 kDa) pada 1 unit per mg SPACA6 berbanding 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 dan 150 mM NaCl (penampan B) untuk dialisis.) pada 4°C selama 48 jam.SPACA6 yang dibelah thrombin kemudiannya dicairkan tiga kali ganda untuk mengurangkan kepekatan garam dan dimuatkan pada lajur pertukaran kation MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) 1 ml MonoS 5/50 diseimbangkan dengan 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Penukar kation telah dibasuh dengan 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, kemudian SPACA6 dicairkan dengan kecerunan linear dari 0 hingga 500 mm NaCl dalam 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 untuk 25 OK.Selepas kromatografi pertukaran ion, SPACA6 tertumpu kepada 1 ml dan dielusi secara isokratik daripada lajur ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) yang diseimbangkan dengan penimbal B. Menurut kromatogram, pecahan kumpulan dan pekat yang mengandungi SPACA6.Ketulenan dikawal oleh elektroforesis bernoda Coomassie pada gel SDS-polyacrylamide 16%.Kepekatan protein dikira dengan penyerapan pada 280 nm menggunakan undang-undang Beer-Lambert dan pekali kepupusan molar teori.
SPACA6 yang telah disucikan telah didialisis semalaman terhadap 10 mM natrium fosfat, pH 7.4 dan 150 mM NaF dan dicairkan kepada 0.16 mg/mL sebelum dianalisis oleh spektroskopi CD.Pengimbasan spektrum CD dengan panjang gelombang 185 hingga 260 nm dikumpul pada spektropolarimeter Jasco J-1500 menggunakan kuvet kuarza dengan panjang laluan optik 1 mm (Helma) pada 25°C pada kadar 50 nm/min.Spektrum CD telah diperbetulkan garis dasar, dipuratakan lebih 10 pemerolehan, dan ditukar kepada min elipsiti sisa (θMRE) dalam darjah cm2/dmol:
di mana MW ialah berat molekul setiap sampel dalam Da;N ialah bilangan asid amino;θ ialah eliptik dalam milidegree;d sepadan dengan panjang laluan optik dalam cm;kepekatan protein dalam unit.