310 10*1mm Komponen kimia tiub bergelung keluli tahan karat, Domain terminal N spidroin membentuk hidrogel berdasarkan fibril amiloid dan menyediakan platform untuk imobilisasi protein.

Terima kasih kerana melawat Nature.com.Anda menggunakan versi penyemak imbas dengan sokongan CSS terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami menunjukkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Peluncur menunjukkan tiga artikel setiap slaid.Gunakan butang belakang dan seterusnya untuk bergerak melalui slaid, atau butang pengawal slaid di hujung untuk bergerak melalui setiap slaid.

Spesifikasi

310 10*1mm Pembekal tiub bergelung keluli tahan karat

Komposisi kimia

Sifat Mekanikal

Protein sutera labah-labah rekombinan (protein sutera labah-labah) mempunyai banyak aplikasi yang berpotensi dalam pembangunan biomaterial baharu, tetapi sifat multimodal dan mudah terkumpul menjadikannya sukar diperoleh dan mudah digunakan.Di sini kami melaporkan bahawa protein spidroin miniatur rekombinan dan, yang penting, domain N-terminal (NT) itu sendiri dengan cepat membentuk hidrogel yang menyokong diri dan telus pada 37 ° C.protein gabungan yang terdiri daripada NT dan protein pendarfluor hijau atau fosforilase nukleosida purin membentuk protein pelakuran berfungsi sepenuhnya.Hidrogel.Keputusan kami menunjukkan bahawa protein NT dan gabungan rekombinan memberikan hasil ekspresi yang tinggi dan memberikan hidrogel dengan sifat yang menarik seperti ketelusan, gelilasi tanpa penghubung silang, dan imobilisasi langsung protein aktif pada ketumpatan tinggi.
Labah-labah mempunyai sebanyak tujuh set kelenjar sutera yang berbeza, setiap satu menghasilkan jenis sutera tertentu.Kesemua tujuh spesies sutera terdiri daripada protein sutera labah-labah (spidroin) kira-kira 6000 sisa panjang dan mengandungi kawasan ulangan pusat yang besar yang dikelilingi oleh domain terminal N- dan C sfera (NT dan CT)1,2.Jenis sutera yang paling banyak dikaji, ampula primer, dihasilkan oleh kelenjar ampula primer.Dalam kelenjar ini, satu lapisan sel epitelium mensintesis protein spidroin dan merembeskannya ke dalam lumen kelenjar, di mana ia terdapat dalam bentuk larut (doping) pada kepekatan yang sangat tinggi (30–50% b/v)3,4.Organisasi dan konformasi protein spidroin ampullar utama dalam kelenjar telah dibahaskan, tetapi kebanyakan bukti eksperimen menunjukkan kehadiran konformasi heliks secara amnya heliks dan/atau rawak dan struktur misel atau lamellar5,6,7,8,9,10.Walaupun domain berulang mengawal sifat mekanikal gentian sutera, membentuk nanokristal lembaran β dan struktur amorf11,12,13,14,15, domain akhir mengawal gentian sutera sebagai tindak balas kepada perubahan keadaan di sepanjang kelenjar sutera16,17,18.Dengan mengawal pembentukan sutera, 19. Domain terminal dipelihara secara evolusi dan fungsinya mungkin biasa kepada semua protein spidroin 2,20,21.Semasa laluan melalui kelenjar, pH spidroin berkurangan daripada kira-kira 7.6 kepada < 5.716 dan meningkat dengan ricih dan regangan yang dimediasi oleh pergerakan melalui saluran yang semakin menyempit.Dalam larutan, CT ialah dimer selari konstitutif α-heliks17, tetapi sebagai tindak balas kepada pH rendah dan daya ricih, CT membuka dan menukar β-lapisan16, 17, mungkin mencetuskan lapisan β di kawasan berulang Convert 16. NT adalah monomer di bawah keadaan yang mencerminkan keadaan dalam lumen kelenjar dan mengantara keterlarutan spidroin, tetapi pada pH yang dikurangkan, protonasi beberapa rantai sampingan asid karboksilik membawa kepada dimerisasi NT dengan pKa kira-kira 6.5, dengan itu menstabilkan NT dan membetulkan spidroin dalam saiz besar. kuantiti.rangkaian16,18.Oleh itu, NT memainkan peranan penting dalam pembentukan filamen, berubah daripada monomer dalam salutan kepada dimer dalam gentian23,24,25.NT kekal sangat larut dan heliks di bawah semua keadaan yang dikaji sehingga kini16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, yang memberi inspirasi kepada perkembangannya sebagai label peningkatan keterlarutan untuk pengeluaran protein heterolog.
Protein sutera labah-labah mini rekombinan, yang terdiri daripada satu NT, satu kawasan ulangan pendek, satu CT, dan tag His6 (His-NT2RepCT) untuk penulenan, adalah larut dalam penampan akueus seperti protein sutera labah-labah asli dan meniru ciri penting asli labah-labah sutera .liputan 25.31.His-NT2RepCT boleh dipintal menjadi gentian berterusan menggunakan mesin biomimetik di mana salutan larut pH 8 diekstrusi ke dalam tab mandi air pH 525,32,33,34,35.Penapaian bioreaktor E. coli yang mengekspresikan His-NT2RepCT dan selepas rawatan seterusnya menghasilkan hasil >14 g/L selepas penulenan.Hasil tinggi, keterlarutan tinggi, dan tindak balas yang mencukupi bagi His-NT2RepCT kepada keadaan berasid semuanya dikaitkan dengan NT23, 25, 34.
Di sini kami melaporkan pembentukan pesat hidrogel telus daripada protein spidroin rekombinan, termasuk NT sahaja, dengan mengeram larutan protein pada 37 ° C.Menggunakan pendarfluor thioflavin T (ThT), spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR), spektroskopi resonans magnetik nuklear (NMR) dan mikroskop elektron penghantaran (TEM), kami mendapati bahawa protein NT dan mikrospider mengalami transformasi struktur menjadi lembaran β dan fibril seperti amiloid. apabila gel terbentuk.Di samping itu, protein gabungan NT dan protein pendarfluor hijau (GFP) atau purine nucleoside phosphorylase (PNP) membentuk hidrogel dengan serpihan gabungan berfungsi sepenuhnya.Ekspresi prestasi tinggi dalam perumah heterolog, ditambah dengan pembentukan hidrogel yang cepat di bawah keadaan fisiologi, membuka kemungkinan pengeluaran hidrogel yang kos efektif dengan fungsi kejuruteraan.
Tidak seperti kebanyakan protein spidroin rekombinan yang dilaporkan36, His-NT2RepCT stabil dalam penimbal Tris-HCl pada pH 8 dan boleh tertumpu sehingga 500 mg/mL tanpa kerpasan25.Oleh itu, kami terkejut apabila mendapati bahawa protein ini dengan cepat membentuk hidrogel yang jelas secara optikal, menyokong diri apabila diinkubasi pada 37°C (Rajah 1b-d).Kajian lanjut menunjukkan bahawa penggelapan His-NT2RepCT berlaku pada julat luas kepekatan protein (10-300 mg/mL) dan kepekatan ini berkorelasi songsang dengan masa penggelapan (Rajah 1c dan Rajah Tambahan 1).Untuk mengetahui bahagian mana dalam pembentukan hidrogel pengantara His-NT2RepCT, kami kemudian memeriksa setiap domain secara individu dan dalam pelbagai kombinasi menggunakan ujian penyongsangan kelalang (Rajah 1a, b).Semua pecahan yang diuji bagi spidroin rekombinan membentuk gel (pada kepekatan protein 300 mg/mL) dalam masa kurang daripada 1 jam, kecuali bagi termendak 2Rep (Rajah 1b).Ini menunjukkan bahawa NT dan CT sahaja, dalam kombinasi, atau dikaitkan dengan ulangan, boleh gel pada 37°C dan tag His6 tidak menjejaskan proses ini ke tahap yang ketara.Memandangkan tanggapan umum bahawa NT adalah protein yang sangat larut dan stabil, dan laporan terdahulu mengenai hidrogel spidroin rekombinan telah mengaitkan kesan pemgelapan kepada perubahan konformasi di kawasan berulang dan/atau CT, NT sendiri boleh.Penemuan penggelapan adalah tidak dijangka.Jadual Tambahan 1) 37, 38, 39. Hebatnya, NT sudah digel dalam masa 10 minit pada kepekatan ≥ 300 mg/mL (Rajah 1c).Eksperimen penyongsangan vial dengan pelbagai kepekatan NT menunjukkan bahawa pada> 50 mg/mL larutan NT bergel lebih cepat daripada His-NT2RepCT pada kepekatan yang sepadan (w/v, Rajah 1c).
Perwakilan skematik pelbagai konstruk spidroin yang dikaji dalam kerja ini.b Masa gel pada 37 °C untuk pelbagai protein spidroin rekombinan (300 mg/mL) disahkan dengan menyongsangkan vial.Gel CT serta-merta tanpa pengeraman (<300 mg/mL), mendakan 2Rep (300 mg/mL, skala 5 mm).c Masa gel His-NT2RepCT dan NT pada kepekatan protein yang ditunjukkan pada 37°C.d Gambar-gambar hidrogel His-NT2RepCT dan NT dengan labah-labah dan huruf “NT” dicetak di bawahnya (kedua-duanya 200 mg/mL, bar skala 5 mm).
Hidrogel yang dibentuk oleh pelbagai protein spidroin rekombinan mempunyai warna yang sedikit berbeza, dan pemerhatian mata kasar menunjukkan tahap ketelusan yang berbeza-beza (Rajah 1b).Gel NT sangat jelas manakala gel lain menjadi legap.Gel His-NT2RepCT dan NT yang dibuang ke dalam tiub silinder boleh dikeluarkan daripada acuan utuh (Rajah 1d).
Untuk menguji sama ada gel salutan sutera labah-labah semula jadi dalam keadaan yang kini didapati menyebabkan penggelapan protein spidroin rekombinan, salutan dikumpulkan daripada kelenjar ampula besar labah-labah jambatan Sweden (Larinioides sclopetarius).Salutan disimpan dalam penimbal Tris-HCl 20 mM pada 50 mg / mL (berdasarkan berat kering yang diukur), tetapi tiada penggelapan diperhatikan semasa pengeraman 21 hari pada 37 ° C (Tambahan Rajah 2a).
Untuk mengukur gel ini, ukuran rheologi boleh digunakan untuk mengkaji proses penggelapan dan menentukan sifat mekanikal keseluruhan.Khususnya, memantau modulus penyimpanan (keanjalan) pada suhu tinggi boleh memberikan maklumat tentang suhu pengegelan serta sifat viskoelastik salutan.Eksperimen kenaikan suhu (menggunakan 1°C/min pada 25-45°C, berdasarkan kajian terdahulu menggunakan larutan stok sutera asli)40,41 menunjukkan moduli penyimpanan larutan His-NT2RepCT dan NT meningkat dengan peningkatan suhu .telah meningkat (Rajah 2 dan Rajah Tambahan 3).Terutama, modul NT mula berkembang pada suhu yang lebih rendah berbanding dengan His-NT2RepCT, selaras dengan masa gel yang lebih cepat diperhatikan apabila NT diinkubasi secara langsung dengan His-NT2RepCT pada 37 ° C (Rajah 1).Selepas penurunan suhu berikutnya, modulus storan tidak kembali kepada nilai yang lebih rendah dan kekal di atas modulus kehilangan (lihat Rajah Tambahan 3), menunjukkan gelasi stabil tidak boleh balik secara terma.Selepas penggelapan, modulus anjal akhir berjulat antara 15 hingga 330 kPa untuk hidrogel His-NT2RepCT pada kepekatan 100-500 mg/mL, dan modulus elastik akhir untuk hidrogel NT (100-500 mg/mL) adalah antara 2 hingga 1400 kPa (Rajah , 2 dan data tanjakan lengkap) lihat Rajah Tambahan 3).
a Perubahan suhu semasa pengukuran His-NT2RepCT (300 mg/mL) dan b NT (300 mg/mL) dengan goncangan.Anak panah menunjukkan arah aliran suhu, dan teduhan yang lebih terang bagi data modul storan menggambarkan ujian pada nilai tork yang lebih rendah untuk instrumen daripada yang ditentukan oleh pengilang, yang merupakan punca peningkatan bunyi.c Pengumpulan modul akhir His-NT2RepCT dan NT selepas suhu tinggi (100, 300, dan 500 mg/mL).Semua bacaan modul diambil pada frekuensi 0.1 Hz.
Sebagai kaedah yang berpotensi untuk menyiasat perubahan konformasi yang berkaitan dengan penggelapan, kami merekodkan spektrum FTIR His-NT2RepCT dan NT sebelum dan selepas penggelapan pada 37 ° C (Rajah 3a, b).Seperti yang dijangkakan, spektrum penyelesaian His-NT2RepCT dan NT sepadan dengan protein yang menunjukkan struktur sekunder α-helix/gegelung rawak, dengan jalur yang jelas pada 1645 cm-1.Bagi kedua-dua hidrogel, gelation menghasilkan pembentukan dua lengan pada jalur I tengah pada kira-kira 1617 cm-1 dan 1695 cm-1 (Rajah 3a, b), menunjukkan pembentukan struktur lembaran β antiselari.Perubahan ini juga boleh dilihat dengan jelas dalam spektrum derivatif dan perbezaan kedua masing-masing (Tambahan Rajah 4b).Kedua-dua jalur lapisan β NT lebih ketara daripada His-NT2RepCT, menunjukkan bahawa jumlah kandungan jalur lapisan β dalam hidrogel NT adalah lebih tinggi daripada hidrogel NT2RepCT.
spektrum penyerapan FTIR His-NT2RepCT dan b NT (kedua-duanya 500 mg/mL) sebelum (larutan) dan selepas pengeraman (gel) pada 37°C.c imej TEM bagi gel NT2RepCT 50 mg/ml dan d NT yang digantung semula.Bar skala 200 nm.e Diameter gentian hidrogel His-NT2RepCT dan NT.n = 100 fibril yang diukur, p < 0.0001.Bar ralat menunjukkan sisihan piawai.Pusat bar ralat ialah min.Ujian-t tidak berpasangan (dua ekor) digunakan untuk analisis statistik.f ThT pendarfluor pelbagai protein spidroin rekombinan (100 mg/mL) pada 37 °C tanpa goncang.g Eksperimen inokulasi NT (100 mg/mL) daripada 100 mg/mL gel NT dengan biji benih 0%, 5%, 10% dan 20%.
Analisis gel menggunakan mikroskop elektron penghantaran (TEM) menunjukkan bahawa hidrogel terdiri daripada fibril seperti amiloid (Rajah 3c, 3d).Fibril yang terbentuk NT adalah memanjang (diameter 5–12 nm) dan tidak bercabang, manakala gentian His-NT2RepCT lebih pendek panjangnya dan diameter lebih ketara (7–16 nm) (Rajah 3e).Keputusan ini membolehkan kami mengikuti kinetik fibrosis menggunakan ujian thioflavin T (ThT).Untuk semua protein spidroin rekombinan, isyarat pendarfluor meningkat apabila sampel diinkubasi pada 37 °C (Rajah 3f, Rajah Tambahan 5a).Selaras dengan penemuan ini, pemeriksaan mikroskopik NT dan His-NT2RepCT di bawah keadaan pembentuk gel mendedahkan peningkatan seragam dalam pendarfluor ThT tanpa pengumpulan tempatan agregat positif ThT yang ketara (Tambahan Rajah 5b, c).Pembentukan fibril ThT-positif tidak disertai dengan peningkatan kekeruhan NT dan His-NTCT (Tambahan Rajah 5d), yang bermaksud bahawa rangkaian fibril dalam gel boleh terbentuk tanpa menjejaskan kejelasan gel.Penyemaian dengan menambahkan sedikit fibril pra-bentuk boleh mempercepatkan pembentukan fibril beberapa amiloid dengan ketara42,43,44 tetapi menambah 5%, 10% atau 20% (b/b) NT kepada larutan hidrokoagulan NT.kesan pembenihan (Gamb. 3g).Mungkin ini disebabkan oleh fakta bahawa fibril dalam hidrogel agak tetap dan tidak boleh digunakan sebagai benih.
Kelakuan tidak dijangka protein spidroin rekombinan pada suhu tinggi mendorong kajian spektroskopi resonans magnetik nuklear (NMR) lanjut untuk mengenal pasti perubahan konformasi yang berkaitan dengan pembentukan gel.Spektrum NMR bagi penyelesaian His-NT2RepCT yang direkodkan dari semasa ke semasa pada suhu 37°C menunjukkan bahawa CT masih sebahagiannya dilipat, manakala isyarat NT dan 2Rep telah hilang (Rajah 4a), menunjukkan bahawa ia adalah terutamanya NT dan 2Rep yang mengawal separa pembentukan His- Hidrogel NT2RepCT.Isyarat CT juga dilemahkan kepada 20% daripada keamatan asalnya, menunjukkan bahawa CT juga kebanyakannya tetap dan dimasukkan ke dalam struktur hidrogel.Untuk bahagian CT yang lebih kecil, yang mudah alih seperti dalam sampel prainkubasi dan dengan itu diperhatikan oleh larutan NMR, spektrum kekurangan isyarat untuk 10 sisa berstruktur pertama, mungkin disebabkan oleh imobilisasi yang sukar bagi bahagian yang dilampirkan His-NT2Rep .Spektrum NMR bagi -keadaan hidrogel -NT2RepCT mendedahkan kehadiran utama α-heliks dan lapisan β dan, pada tahap yang lebih rendah, konformasi gegelung rawak (Rajah 4b).Analisis anjakan kimia sisa metionin hanya terdapat dalam NT menunjukkan bahawa domain ini telah ditukar kepada struktur helaian β.Spektrum bergantung masa NT dalam larutan menunjukkan penurunan seragam dalam intensiti isyarat (Rajah 4c), dan NMR keadaan pepejal hidrogel NT menunjukkan bahawa kebanyakan sisa NT telah ditukar kepada struktur helaian β (Rajah 4d).Konformasi 2Rep tidak dapat ditentukan secara berasingan kerana kecenderungannya untuk mengagregat.Walau bagaimanapun, spektrum NMR keadaan pepejal hidrogel NTCT dan His-NT2RepCT kelihatan sangat serupa (Rajah 4b; Rajah Tambahan 6b), menunjukkan bahawa 2Rep menyumbang sedikit kepada bahagian struktur hidrogel His-NT2RepCT.Untuk hidrogel CT, α-heliks, β-helaian, dan struktur sekunder heliks rawak didapati wujud (Tambahan Rajah 6d).Ini menunjukkan bahawa sesetengah bahagian CT kekal α-heliks manakala yang lain menjadi helaian β.Oleh itu, keputusan spektroskopi NMR menunjukkan bahawa NT adalah penting untuk pembentukan hidrogel dan juga berubah menjadi konformasi lembaran β apabila gabungan dengan 2Rep dan CT.Selaras dengan ini, baru-baru ini kami mendapati bahawa ritsleting spatial amiloid mungkin terbentuk dalam semua lima heliks domain NT, dan algoritma Waltz meramalkan rantau amiloidogenik dalam heliks 1 (Rajah 4e).
Spektrum 2D larutan 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT sebelum (biru) dan 19 jam selepas pengeraman (merah) pada 37°C.Puncak silang individu dalam spektrum merah dan F24, G136, poliA dalam spektrum biru dilambangkan dengan simbol asid amino huruf tunggal dan nombor sisa.Inset menunjukkan pergantungan keamatan isyarat pada masa untuk sisa terpilih daripada domain NT, 2Rep dan CT.b Spektrum frekuensi radio keadaan pepejal (RFDR) hidrogel His-NT2RepCT.Korelasi sisa Cα/Cβ yang diperhatikan dalam spektrum RFDR ditentukan dengan perbandingan dengan anjakan kimia peptida model dan nilai yang diperoleh daripada statistik82,83 dan struktur sekundernya.SSB – jalur sisi berputar.c Spektrum satu dimensi larutan 15N-HSQC 10 mg/mL NT semasa pengeraman pada 37 °C selama 36 jam.Inset menunjukkan keamatan isipadu berbanding masa.d Spektrum RFDR keadaan pepejal hidrogel NT.Korelasi sisa Cα/Cβ dan struktur sekundernya yang diperhatikan dalam spektrum RFDR ditunjukkan.e Berdasarkan profil kecenderungan fibrilasi NT45.79 daripada pangkalan data Zip (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Tenaga Rosetta bagi tetingkap anjakan kilat spatial heksapeptida ditunjukkan dalam kcal/mol.Bar merah menandakan heksapeptida dengan kecenderungan fibrosis yang tinggi (tenaga Rosetta di bawah -23 kcal/mol; di bawah garis putus-putus).Bar hijau menunjukkan serpihan dengan tenaga Rosetta di atas ambang dan oleh itu kurang berkemungkinan membentuk ritsleting sterik.Serpihan yang mengandungi prolin dikecualikan daripada analisis (tanpa lajur).Petak menunjukkan kawasan amyloidosis yang diramalkan oleh algoritma Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Urutan sisa asid amino NT berada di bahagian atas, dan jenis sisa yang terdapat dalam struktur sekunder β (ditentukan oleh spektroskopi NMR keadaan pepejal) ditunjukkan dalam warna merah.Kedudukan lima heliks NT α ditetapkan sebagai (H1-H5)28.
Pada pH <6.5, HT menjadi dimer, tahan terhadap denaturasi akibat haba atau urea18.Untuk menjelaskan bagaimana dimerisasi dan kestabilan NT mempengaruhi gelasi, larutan yang mengandungi 100 mg/ml NT dikawal pada pH 8, 7, dan 6 menggunakan ujian penyongsangan vial.Sampel NT diinkubasi pada pH 8 dan 7 digel selepas 30 minit pada 37 °C, tetapi gel pH 8 kekal jernih, manakala gel pH 7 menunjukkan mendakan yang boleh dilihat (Rajah 5a).Sebaliknya, larutan yang mengandungi HT pada pH 6 tidak membentuk gel, dan mendakan besar dapat dilihat selepas 20 minit pada 37°C.Ini menunjukkan bahawa dimer itu sendiri dan/atau kestabilan mereka yang lebih tinggi berbanding dengan monomer menghalang penggelapan.Pembentukan mendakan untuk NT pada pH 7 dan 6 tidak dijangka, kerana telah dilaporkan bahawa NT larut pada 200 mg/ml27, mudah dilipat semula selepas denaturasi haba, dan juga mengekalkan α-helix pada nilai yang lebih rendah daripada pH 18. Penjelasan yang berkemungkinan untuk percanggahan ini ialah bahawa eksperimen yang dilaporkan sebelum ini telah dijalankan pada suhu bilik atau di bawah, atau pada kepekatan protein yang agak rendah16,18,19.
Ujian penyongsangan vial NT (100 mg/mL) pada pH 8, 7, 6 dan 154 mM NaCl (pH 8) selepas pengeraman pada 37°C.b Spektrum CD NT dengan dan tanpa 154 mM NaF dan 154 mM NaCl, masing-masing.Eliptik molar pada 222 nm ditukar kepada bahagian lipatan semula jadi.c Ujian penyongsangan NT (100 mg/mL) NT* (37 °C dan 60 °C), NTA72R (37 °C) dan His-NT-L6 (37 °C dan 60 °C).d Spektrum CD mutan NT NT*, NTA72R, dan His-NT-L6.Eliptik molar pada 222 nm ditukar kepada bahagian lipatan semula jadi.e Ujian penyongsangan NTFlSp, NTMiSp dan NTMiSp terkurang (100 mg/mL).Bar skala 5 mm.f Spektrum CD NT, NTFlSp, NTMiSp dan NTMiSp terkurang.Eliptik molar pada 222 nm ditukar kepada bahagian lipatan semula jadi.Spektrum NT penuh pada 25 ° C dan 95 ° C ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 8.
Kepekatan garam fisiologi menentukan interaksi elektrostatik antara subunit NT dan dimerisasi pemindahan NT ke pH18 yang lebih rendah.Kami mendapati bahawa kehadiran 154 mM NaCl dan NaF sememangnya menghalang penggelapan, masing-masing (Rajah 5a, b; Rajah Tambahan 2b) dan bahawa garam ini meningkatkan kestabilan terma monomer NT (Rajah 5b, Rajah Tambahan 8) .Ia juga mencadangkan bahawa peningkatan kestabilan, bukannya dimerisasi, menghalang pembentukan gel.
Untuk meneroka lebih lanjut peranan dimerisasi protein dan kestabilan dalam gelasi, kami menggunakan dua mutan, NT* dan NTA72R, yang juga kekal monomerik pada pH28.30 rendah.NT* ialah mutan pembalikan cas berganda di mana taburan cas dipolar jelas bagi monomer diratakan, yang menghalang dimerisasi dan secara drastik meningkatkan kestabilan monomer.NTA72R ialah dipol bercas, tetapi Ala yang digantikan Arg terletak di sempadan dimer, jadi mutasi mengganggu interaksi subunit yang diperlukan untuk dimerisasi.Selepas pengeraman pada 37°C, NT* tidak membentuk hidrogel, manakala NTA72R membentuk gel legap selama 15 minit (Rajah 5c).Memandangkan kedua-dua NT* dan NTA72R tidak boleh dimerisasi tetapi berbeza dalam kestabilan monomer (Rajah 5d), keputusan ini amat mencadangkan bahawa kestabilan termodinamik yang tinggi menghalang NT daripada mengegel.Ini juga disokong oleh fakta bahawa HT* membentuk gel apabila ia tidak stabil pada suhu tinggi (selepas 8 min pada 60°C; Rajah 5c).Sebelum ini telah ditunjukkan bahawa kandungan metionin yang tinggi dalam NT mencairkan lipatan semula jadinya dan enam pengganti Met to Leu (dirujuk di sini sebagai His-NT-L6) menstabilkan monomer NT46 dengan kuat.Berdasarkan andaian bahawa fleksibiliti struktur diperlukan untuk pembentukan gel NT, kami mendapati bahawa mutan stabil His-NT-L6 tidak gel pada 37 ° C (Rajah 5c, d).Walau bagaimanapun, His-NT-L6 juga membentuk gel semasa pengeraman pada 60°C selama 60 minit (Rajah 5c).
Keupayaan NT untuk berubah menjadi struktur lembaran β dan membentuk hidrogel nampaknya terpakai kepada beberapa tetapi tidak semua domain NT spidroin.NT daripada jenis sutera dan spesies labah-labah yang berbeza, Trichonephila clavipes (NTFlSp), membentuk gel walaupun kandungan metioninnya agak rendah dan kestabilan haba yang tinggi (Rajah 5e, f dan Jadual Tambahan 2).Sebaliknya, NT daripada spidroin protein ampullar kecil daripada Araneus ventricosus (NTMiSp) dengan kestabilan haba yang rendah dan kandungan metionin yang tinggi tidak membentuk hidrogel (Jadual Tambahan 2 dan Rajah 5e, f).Yang terakhir ini mungkin dikaitkan dengan kehadiran ikatan disulfida intramolekul29,47.Secara konsisten, apabila ikatan disulfida NTMiSp dikurangkan, ia membentuk hidrogel selepas pengeraman pada 37°C selama 10 minit (Rajah 5e).Sebagai kesimpulan, perlu diingatkan bahawa fleksibiliti struktur adalah kriteria penting, tetapi bukan satu-satunya, untuk pembentukan gel dari NT.Faktor lain yang mungkin relevan ialah kecenderungan untuk membentuk fibril amiloid, dan analisis dengan pangkalan data zip dan algoritma Waltz memang menunjukkan korelasi antara keupayaan untuk membentuk gel dan kehadiran kawasan amiloidogenik, serta tahap kawasan yang diramalkan. untuk membentuk ritsleting sterik.Terdapat korelasi (Jadual Tambahan 2 dan Rajah Tambahan 9).
Keupayaan NT untuk membentuk fibril dan membentuk gel dalam keadaan yang menggalakkan menyebabkan kami membuat hipotesis bahawa gabungan NT dengan serpihan protein lain masih boleh membentuk gel dengan fungsi penuh rakan gabungan.Untuk menguji ini, kami memperkenalkan protein pendarfluor hijau (GFP) dan purine nucleoside phosphorylase (PNP) di terminal C NT, masing-masing.Protein gabungan yang terhasil dinyatakan dalam E. coli dengan hasil akhir yang sangat tinggi (150 mg/L dan 256 mg/L kultur kelalang goncang untuk His-NT-GFP dan His-NT-PNP, masing-masing), selaras dengan apa yang telah ditunjukkan. untuk Protein lain yang digabungkan dengan NT Ref.30. Protein gabungan His-NT-GFP (300mg/mL) dan His-NT-PNP (100mg/mL) membentuk gel selepas 2 jam dan 6.5 jam pada suhu 37°C dan, yang penting, pecahan GFP kekal tidak berubah.diperhatikan selepas pengagelapan, dengan> 70% daripada keamatan pendarfluor awal kekal selepas pengegelan (Rajah 6a).Untuk mengukur aktiviti PNP dalam larutan dan gel-NT-PNPnya, kami terpaksa mencairkan protein gabungan dengan NT kerana aktiviti enzimatik penyediaan tulen berada di luar julat pengesanan ujian pada kepekatan gel.Gel yang terbentuk dengan campuran yang mengandungi 0.01 mg/mL His-NT-PNP dan 100 mg/mL NT mengekalkan 65% daripada aktiviti enzimatik awal sampel prainkubasi (Rajah 6b).Gel kekal utuh semasa pengukuran (Tambahan Rajah 10).
Keamatan pendarfluor relatif sebelum dan selepas penggelapan His-NT-GFP (300 mg/mL) dan botol terbalik yang mengandungi hidrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) di bawah cahaya boleh dilihat dan UV.Mata menunjukkan ukuran individu (n = 3), bar ralat menunjukkan sisihan piawai.Nilai purata ditunjukkan di tengah-tengah bar ralat.b Aktiviti PNP diperolehi dengan analisis fluorometri menggunakan larutan dan gel yang terdiri daripada NT (100 mg/ml) dan campuran yang mengandungi 0.01 mg/ml his-NT-PNP dan 100 mg/ml dolar Taiwan Baru.Inset menunjukkan vial terbalik yang mengandungi hidrogel yang mengandungi His-NT-PNP (bar skala 5 mm).
Di sini, kami melaporkan pembentukan hidrogel daripada NT dan protein spidroin rekombinan lain dengan mengeram larutan protein pada 37 ° C (Rajah 1).Kami menunjukkan bahawa penggelapan dikaitkan dengan transformasi α-heliks kepada lapisan β dan pembentukan fibril seperti amiloid (Rajah 3 dan 4).Penemuan ini mengejutkan kerana NT ialah berkas lima heliks globular bergelung yang terkenal dengan keterlarutan yang sangat tinggi dan kestabilan tinggi pada kepekatan >200 mg/mL pada 4°C selama beberapa hari27.Di samping itu, NT mudah dilipat semula selepas denaturasi haba pada kepekatan protein rendah dalam µM.Menurut keputusan kami, pembentukan fibril memerlukan gabungan >10 mg/mL kepekatan protein dan suhu yang sedikit dinaikkan (Rajah 1).Ini selaras dengan idea bahawa fibril amiloid boleh terbentuk daripada protein terlipat globular yang berada dalam keadaan terbentang separa akibat turun naik haba di bawah keadaan fisiologi 48 .Contoh protein yang mengalami penukaran ini termasuk insulin49,50, β2-mikroglobulin, transthyretin dan lysozyme51,52,53.Walaupun NT ialah α-helix dalam keadaan asalnya, kira-kira 65% rantai polipeptida serasi dengan pembentukan zip sterik (Rajah 4e) 45 .Memandangkan monomer bergerak secara dinamik46, ia boleh mendedahkan kawasan amiloidogenik yang berpotensi ini pada suhu yang sederhana tinggi dan pada kepekatan tinggi jumlah protein boleh mencapai kepekatan kritikal untuk pembentukan fibril amiloid54.Berikutan alasan ini, kami mendapati korelasi negatif antara kepekatan spidroin dan masa gelasi (Rajah 1c), dan jika konformasi NT monomerik distabilkan sama ada oleh mutasi (NT*, His-NT-L6) atau dengan penambahan garam, boleh menghalang pembentukan hidrogel (Rajah 5).
Dalam kebanyakan kes, fibril amiloid hilang daripada larutan sebagai mendakan, tetapi dalam keadaan tertentu ia boleh membentuk hidrogel55,56,57.Fibril pembentuk hidrogel biasanya mempunyai nisbah aspek yang tinggi dan membentuk rangkaian tiga dimensi yang stabil melalui belitan molekul, 55,58 selaras dengan keputusan kami.Untuk pembentukan hidrogel secara in vitro, protein selalunya terbentang sepenuhnya atau sebahagian, contohnya, melalui pendedahan kepada pelarut organik, suhu tinggi (70–90°C) dan/atau pH rendah (1.5–3.0)59,60,61,62.Hidrogel spidroin yang diterangkan di sini tidak memerlukan pemprosesan yang keras, dan juga tidak memerlukan agen penghubung silang untuk menstabilkan hidrogel.
Sebelum ini telah dilaporkan bahawa pengulangan spidroin dan QD, yang nampaknya mengalami penukaran lembaran β semasa pemintalan sutera, membentuk hidrogel.Berbanding dengan penemuan kami, masa inkubasi dan / atau suhu pengeraman adalah lebih lama atau lebih tinggi, masing-masing, dan hidrogel yang terhasil selalunya legap (Rajah 7 dan Jadual Tambahan 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Selain masa gel yang cepat, hidrogel NT >300 mg/mL (30%) mengatasi semua hidrogel protein sutera labah-labah rekombinan lain yang diterangkan, serta hidrogel semula jadi seperti gelatin, alginat (2%), agar (0.5 % ) dan kolagen.(0.6%) (Rajah 7 dan Jadual Tambahan 1 dan 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Masa gel dan modulus keanjalan hidrogel dalam kajian ini dibandingkan dengan hidrogel berasaskan spidroin lain dan hidrogel semula jadi terpilih.Rujukan diberikan bersama-sama dengan penerangan tentang keadaan geli.APS Ammonium persulfate, suhu bilik.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Labah-labah nampaknya telah membangunkan cara untuk menghalang spidron daripada menjadi gel semasa penyimpanan.Walaupun kepekatan protein yang tinggi dalam kelenjar sutera, kawasan ulangan besar yang dikaitkan dengan domain terminal bermakna kepekatan ketara NT dan CT dalam kelenjar sepadan dengan kira-kira 10-20 mg/ml, di sempadan kajian ini.diperlukan untuk pembentukan hidrogel yang diperhatikan secara in vitro.Di samping itu, kepekatan garam yang serupa 16 menstabilkan NT, seperti dalam kelenjar sutera (Rajah 5b).Konformasi NT telah dikaji dalam sitosol E. coli dan didapati lebih terlipat rapat berbanding apabila diperiksa secara in vitro, seterusnya menunjukkan bahawa garam atau faktor lain menghalang pengagregatannya dalam vivo.Walau bagaimanapun, keupayaan NT untuk berubah menjadi fibril helaian β mungkin penting untuk pembentukan filamen dan perlu disiasat dalam kajian masa depan.
Sebagai tambahan kepada aspek novel pembentukan fibril dan hidrogel seperti NT-amyloid yang diperhatikan dalam kajian ini, kami juga menunjukkan bahawa fenomena ini mungkin mempunyai aplikasi bioteknologi dan bioperubatan (Rajah 8).Sebagai bukti konsep, kami menggabungkan NT dengan GFP atau PNP dan menunjukkan bahawa protein gabungan juga membentuk hidrogel apabila diinkubasi pada 37 ° C dan bahawa pecahan GFP dan PNP sebahagian besarnya mengekalkan aktiviti mereka selepas gelation (Rajah 6).Fosforilase nukleosida ialah sintesis pemangkin penting bagi analog nukleosida75, yang menjadikan penemuan kami relevan untuk industri biofarmaseutikal.Konsep mengekspresikan protein gabungan yang membentuk hidrogel telus di bawah keadaan yang menggalakkan membolehkan penciptaan hidrogel yang difungsikan dengan sifat yang menggalakkan untuk pelbagai aplikasi seperti imobilisasi enzim, pelepasan dadah terkawal dan kejuruteraan tisu.Di samping itu, NT dan NT* adalah penanda ekspresi yang cekap30, yang bermaksud bahawa NT dan variannya boleh digunakan untuk pengeluaran tinggi protein gabungan larut dan penciptaan protein sasaran tidak bergerak dalam hidrogel 3D yang seterusnya.
NT larut, α-heliks dan stabil pada kepekatan rendah (µM) dan 37°C.Pada suhu yang sama, tetapi pada peningkatan kepekatan (>10 mg/ml), NT membentuk gel yang terdiri daripada fibril seperti amiloid.Protein gabungan NT juga membentuk gel fibrillar dengan serpihan gabungan berfungsi sepenuhnya, membolehkan pelbagai protein dialihkan dalam hidrogel 3D menggunakan NT.Bawah: NT (PDB: 4FBS) dan ilustrasi rangkaian gentian dan struktur protein yang berkaitan (diandaikan dan tidak dilukis mengikut skala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstruk (lihat Jadual Tambahan 4 untuk senarai lengkap termasuk jujukan asid amino) telah diklon menjadi plasmid pT7 dan diubah menjadi E. coli BL21 (DE3).E. coli yang mengandungi plasmid kejuruteraan telah diinokulasi dalam sup Luria yang ditambah dengan kanamisin (70 mg/l) dan ditanam semalaman pada suhu 30°C dan 250 rpm.Kultur tersebut kemudiannya diinokulasi 1/100 ke dalam medium LB yang mengandungi kanamisin dan dibiakkan pada suhu 30°C dan 110 rpm sehingga OD600 mencapai 0.8.Untuk kajian NMR, bakteria telah ditanam dalam medium minimum M9 yang mengandungi 2 g D-glukosa 13C (Aldrich) dan 1 g ammonium klorida 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) untuk pelabelan protein dengan isotop.Turunkan suhu kepada 20 darjah Celsius dan dorong ekspresi protein dengan 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (kepekatan akhir).Selepas ekspresi protein semalaman, sel dituai pada 7278 × g, 4 ° C selama 20 minit.Pelet sel telah digantung semula dalam 20 mM Tris-HCl, pH 8, dan dibekukan sehingga digunakan selanjutnya.Sel yang dicairkan telah dilisiskan menggunakan pengganggu sel (mesin siri TS, Constant Systems Limited, England) pada 30 kPa.Kemudian lisat diempar pada 25,000 g selama 30 minit pada suhu 4°C.Untuk NTMiSp, pelet kemudian digantung semula dalam 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, dan disonikasi selama 2 minit (2 s hidup/mati, 65%), kemudian disentrifugasi semula pada 25,000 xg, 4° C. dalam 30 min.Supernatan telah dimuatkan pada lajur Ni-NTA, dibasuh dengan 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, dan akhirnya protein telah dielusi dengan 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Untuk menghasilkan NT2RepCT dan NTCT, pencernaan thrombin memperkenalkan tapak (ThrCleav) antara His dan NT.Tapak pembelahan trombin juga terdapat dalam His-NT-ThrCleav-2Rep (menghasilkan 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (menghasilkan NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (menghasilkan CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (menghasilkan NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (menghasilkan NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (menghasilkan NTF1Sp) dan His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (menghasilkan NTMiSp).Konstruk telah dicerna dengan trombin (1:1000) dan didialisis semalaman pada suhu 4° C. dengan 20 mM Tris-HCl, pH 8, menggunakan membran dialisis Spectra/Por dengan ambang berat molekul 6-8 kDa.Selepas dialisis, larutan dimuatkan ke dalam lajur Ni-NTA dan efluen yang mengandungi protein yang diminati dikumpulkan.Kepekatan protein ditentukan dengan mengukur penyerapan UV pada 280 nm menggunakan pekali kepupusan setiap protein, kecuali NTF1Sp, yang menggunakan ujian Bradford mengikut protokol pengeluar.Ketulenan ditentukan oleh elektroforesis gel SDS polyacrylamide (4–20%) dan pewarnaan biru cemerlang Coomassie.Protein ditumpukan menggunakan penapis emparan (VivaSpin 20, GE Healthcare) pada 4000 xg dengan potongan berat molekul 10 kDa dalam kitaran 20 minit.
Cairkan larutan protein dan masukkan 150 µl dengan teliti ke dalam botol septum jernih 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Tiub itu ditutup dan dimeterai dengan parafilem untuk mengelakkan penyejatan.Sampel (n = 3) diinkubasi pada suhu 37°C atau 60°C dan diterbalikkan secara berkala untuk melihat penggelapan.Sampel yang tidak bergel diinkubasi selama sekurang-kurangnya satu minggu.Kurangkan ikatan disulfida NTMiSp dengan 10 mM DTT setiap 10 µM protein.Untuk menganalisis penggelapan salutan sutera labah-labah semula jadi, labah-labah jambatan Sweden telah dipotong, dua kelenjar terkumpul utama diletakkan dalam 200 μl 20 mM Tris-HCl penimbal pH 8 dan dipotong untuk membolehkan salutan itu terpisah daripada kelenjar..Kandungan kelenjar dilarutkan dalam penimbal, 50 µl untuk penentuan berat kering (dengan pengeraman botol terbuka pada 60 °C kepada berat malar) dan 150 µl untuk penggelapan pada 37 °C.
Geometri/alat pengukur diperbuat daripada keluli tahan karat menggunakan plat selari dengan diameter atas 20 mm dan celah 0.5 mm.Panaskan sampel dari 25 °C hingga 45 °C dan kembali kepada 25 °C pada kadar 1 °C seminit menggunakan plat Peltier bawah keluli tahan karat.Pengukuran getaran dilakukan pada frekuensi 0.1 Hz dan di kawasan viskoelastik linear bahan pada regangan 5% dan 0.5% untuk sampel 100 mg/mL dan 300–500 mg/mL, masing-masing.Gunakan ruang kelembapan tersuai untuk mengelakkan penyejatan.Data dianalisis menggunakan Prisma 9.
Untuk mengumpul spektrum inframerah (IR) pada suhu bilik dari 800 hingga 3900 cm–1.Peranti ATR, serta laluan cahaya melalui spektrometer, dibersihkan dengan udara ditapis kering sebelum dan semasa eksperimen.Penyelesaian (500 mg/mL untuk meminimumkan puncak penyerapan air dalam spektrum) telah dipipet ke atas kristal, dan gel (500 mg/mL) telah dibentuk sebelum pengukuran dan kemudian dipindahkan ke kristal (n = 3).1000 imbasan telah direkodkan dengan resolusi 2 cm-1 dan kitaran tugas sifar 2. Derivatif kedua dikira menggunakan OPUS (Bruker) menggunakan julat pelicinan sembilan mata.Spektrum telah dinormalisasi ke kawasan integrasi yang sama antara 1720 dan 1580 cm-1 menggunakan F. Menges "Spectragryph - Perisian Spektroskopi Optik".Dalam spektroskopi ATR-IR, kedalaman penembusan rasuk inframerah ke dalam sampel adalah bergantung kepada nombor gelombang, menghasilkan penyerapan yang lebih kuat pada nombor gelombang yang lebih rendah daripada pada nombor gelombang yang lebih tinggi.Kesan ini tidak diperbetulkan untuk spektrum yang ditunjukkan dalam Rajah.3 kerana ia sangat kecil (Tambahan Rajah 4).Spektrum yang diperbetulkan untuk angka ini dikira menggunakan perisian Bruker OPUS.
Pada dasarnya, kuantifikasi konformasi protein yang komprehensif adalah mungkin selepas penyahkonvolusian komponen yang boleh dipercayai dalam puncak amida I.Walau bagaimanapun, beberapa halangan timbul dalam amalan.Bunyi dalam spektrum boleh muncul sebagai puncak (palsu) semasa penyahkonvolusi.Di samping itu, puncak akibat lenturan air bertepatan dengan kedudukan puncak amida I dan mungkin mempunyai magnitud yang sama untuk sampel yang mengandungi sejumlah besar air, seperti gel akueus yang dikaji di sini.Oleh itu, kami tidak cuba untuk menguraikan sepenuhnya puncak amida I, dan pemerhatian kami hanya perlu dipertimbangkan untuk menyokong kaedah lain seperti spektroskopi NMR.
Penyelesaian 50 mg/ml NT dan His-NT2RepCT telah dijeli semalaman pada suhu 37°C.Hidrogel kemudiannya dicairkan dengan 20 mM Tris-HCl (pH 8) kepada kepekatan 12.5 mg/ml, digoncang dengan baik dan dipipet untuk memecahkan gel.Seterusnya, hidrogel dicairkan 10 kali dengan 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl sampel digunakan pada grid kuprum yang disalut dengan formvar, dan sampel berlebihan dikeluarkan dengan kertas blotting.Sampel dicuci dua kali dengan 5 µl air MilliQ dan diwarnakan dengan 1% uranil formate selama 5 minit.Keluarkan kotoran yang berlebihan dengan kertas penyerap, kemudian keringkan mesh dengan udara.Pengimejan dilakukan pada grid ini menggunakan FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN yang beroperasi pada 100 kV.Imej-imej itu dirakam pada x 26,500 dan x 43,000 pembesaran menggunakan kamera Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Jerman).Bagi setiap sampel (n = 1), 10-15 imej telah direkodkan.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) digunakan untuk analisis imej dan pengukuran diameter gentian (n = 100, gentian berbeza).Prisma 9 digunakan untuk melakukan ujian-t tidak berpasangan (dua ekor).Purata fibril His-NT2RepCT dan NT ialah 11.43 (SD 2.035) dan 7.67 (SD 1.389) nm, masing-masing.Selang keyakinan (95%) ialah -4.246 hingga -3.275.darjah kebebasan = 198, p < 0.0001.
80 µl sampel cecair yang mengandungi 10 µM thioflavin T (ThT) diukur dalam tiga kali ganda (n = 3) dalam keadaan statik menggunakan plat bawah jernih Corning 96-telaga hitam (Corning Glass 3881, USA).Perbezaan pendarfluor direkodkan menggunakan penapis pengujaan 440 nm dan penapis pelepasan 480 nm (FLUOStar Galaxy dari BMG Labtech, Offenburg, Jerman).Isyarat ThT tidak tepu atau dipadamkan, kerana eksperimen dengan kepekatan ThT yang berbeza dilakukan tanpa mengubah keamatan isyarat.Catatkan penyerapan pada 360 nm untuk pengukuran jerebu.Untuk eksperimen pembenihan, gel 100 mg/mL telah dibentuk pada 37° C., digantung semula, dan digunakan untuk pembenihan pada nisbah molar 5%, 10%, dan 20%.Data dianalisis menggunakan Prisma 9.
Cairkan stok His-NT2RepCT dan NT >100 mg/mL pada ais dan tapis melalui penapis 0.22 µm.Kepekatan dikira dengan mengukur penyerapan pada 280 nm menggunakan Nanodrop.Dalam telaga plat tidak mengikat hitam 96-telaga (Corning) dengan bahagian bawah yang jelas, sampel dicairkan kepada 20 mg/ml dalam 20 mM Tris-HCl pH 8 dan dicampur dengan 5 μM ThT (kepekatan akhir), jumlah kepekatan sampel isipadu 50 μl.Sampel diimej setiap 10 minit pada suhu 37 ° C pada mikroskop CellObserver (Zeiss) dengan saluran cahaya yang dihantar dan set penapis pengujaan dan pelepasan FITC untuk pengimejan ThT.Kanta 20x/0.4 digunakan untuk pengimejan.Zen Blue (Zeiss) dan ImageJ (https://imagej.nih.gov/) digunakan untuk analisis imej.Gel juga disediakan daripada larutan NT dan His-NT2RepCT pada kepekatan 50 mg/mL yang mengandungi 20 mM Tris pH 8 dan 5 µM ThT dan diinkubasi pada 37°C selama 90 minit.Kepingan gel telah dipindahkan ke telaga baru yang mengandungi 20 mM Tris, pH 8, dan 5 μM ThT dalam plat bawah 96 telaga hitam yang tidak mengikat.Dapatkan imej pendarfluor hijau dan medan terang pada pembesaran 20x/0.4.ImageJ digunakan untuk analisis imej.
Spektrum NMR penyelesaian diperoleh pada 310 K pada spektrometer Bruker Avance Neo 600 MHz yang dilengkapi dengan QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Sampel NMR yang mengandungi 10 mg/mL protein homogen berlabel 13C, 15N, dilarutkan dalam 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Anjakan kimia NT2RepCT pada pH 6.7 digunakan untuk menetapkan puncak 23 dalam spektrum 2D 15N-HSQC.
Spektrum pejal NMR (MAS) berputar sudut ajaib bagi hidrogel berlabel 13C, 15N telah direkodkan pada spektrometer HD Bruker Avance III pada 800 MHz yang dilengkapi dengan probe tanpa elektron 3.2 mm 13C/15N{1H}.Suhu sampel dikawal menggunakan aliran gas suhu berubah pada 277 K. Resonans putaran dipol dua dimensi (DARR)76 dan spektrum penyambungan semula frekuensi radio (RFDR)77 diperoleh pada frekuensi MAS 12.5 kHz dan 20 kHz, masing-masing.Polarisasi silang (CP) dari 1H hingga 13C dilakukan menggunakan tanjakan linear dari 60.0 hingga 48.0 kHz pada 1H, 61.3/71.6 kHz pada 13C (pada 12.5/20 kHz MAS) dan masa sentuhan 0.5–1 ms.Penyahgandingan Spinal6478 pada 73.5 kHz digunakan semasa pengumpulan data.Masa pemerolehan ialah 10 milisaat dan kelewatan kitaran ialah 2.5 saat.Korelasi Cα/Cβ berkait tunggal yang diperhatikan dalam spektrum RFDR telah ditetapkan berdasarkan anjakan kimia jenis sisa ciri dan korelasi berganda dalam spektrum DARR.
Pangkalan data Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) digunakan untuk menilai kecenderungan flutter dan tenaga Rosetta untuk NT, NTFlSp dan NTMiSp.Pangkalan data Zipper mengira Rosetta Energy80, yang menggabungkan beberapa fungsi tenaga bebas untuk memodelkan dan menganalisis struktur protein.Tahap tenaga -23 kcal/mol atau lebih rendah menunjukkan kecenderungan tinggi untuk fibrilasi.Tenaga yang lebih rendah bermakna lebih kestabilan dua helai β dalam konformasi zip.Di samping itu, algoritma Waltz digunakan untuk meramalkan kawasan amyloidogenik dalam NT, NTFlSp dan NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Larutan protein NT dicampur dengan penimbal asid 2-(N-morpholino)ethanesulfonic (MES) pada pH 5.5 dan 6.0 untuk menurunkan pH kepada pH 6 dan 7, masing-masing.Kepekatan protein akhir ialah 100 mg/ml.
Pengukuran dilakukan pada spektrometer CD J-1500 (JASCO, USA) menggunakan kuvet 300 μL dengan laluan optik 0.1 cm.Protein telah dicairkan kepada 10 μM (n = 1) dalam penimbal fosfat 20 mM (pH 8).Untuk menganalisis kestabilan protein dengan kehadiran garam, protein dianalisis pada kepekatan yang sama (n = 1) dalam penimbal fosfat 20 mM (pH 8) yang mengandungi 154 mM NaF atau NaCl, masing-masing.Imbasan suhu direkodkan pada 222 nm dari 25°C hingga 95°C dengan kadar pemanasan 1°C/min.Perkadaran protein terlipat asli dikira menggunakan formula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Di samping itu, lima spektrum direkodkan untuk setiap sampel dari 260 nm hingga 190 nm pada 25 ° C dan selepas pemanasan hingga 95 ° C.Lima spektrum telah dipuratakan, dilicinkan dan ditukar kepada eliptik molar.Data dianalisis menggunakan Prisma 9.
Keamatan pendarfluor His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) diukur dalam tiga kali ganda (n = 3) dalam plat Corning 96-telaga dengan bahagian bawah lutsinar hitam (Corning Glass 3881, USA) di bawah keadaan statik.Ukur sampel dengan pembaca plat berasaskan pendarfluor dengan panjang gelombang pengujaan 395 nm dan rekodkan pelepasan pada 509 nm sebelum penggelapan dan 2 jam kemudian pada 37°C.Data dianalisis dengan Prisma 9.
Kit ujian aktiviti fosforilase nukleosida purin (kaedah fluorometrik, Sigma Aldrich) telah digunakan mengikut arahan pengilang.Untuk mengukur aktiviti dalam gel dan larutan yang mengandungi His-NT-PNP, campurkan 10 ng His-NT-PNP dengan 100 mg/mL NT kepada jumlah isipadu 2 µL kerana gel memberikan isyarat melebihi selang pengesanan set.Kawalan untuk gel dan penyelesaian tanpa His-NT-PNP dimasukkan.Pengukuran dilakukan dua kali (n = 2).Selepas aktiviti diukur, campuran tindak balas dikeluarkan dan gel diambil gambar untuk memastikan gel kekal utuh semasa pengukuran.Data dianalisis menggunakan Prisma 9.
Untuk maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, lihat abstrak kajian Alam yang dipautkan kepada artikel ini.
Rajah 1 dan 2 membentangkan data awal.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, dan 6, Rajah Tambahan.3, rajah tambahan.5a, d, rajah tambahan.6 dan rajah tambahan.8. Data Data daripada kajian ini dihoskan dalam pangkalan data Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Data NMR yang diperoleh dalam kajian ini telah diposkan ke repositori BMRBig di bawah ID entri bmrbig36.Struktur GFP dan PNP diambil daripada PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. dan Johansson, J. Memusing sutera labah-labah tiruan.Kimia Kebangsaan.biologi.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Genom Nephila clavipes menyerlahkan kepelbagaian gen sutera labah-labah dan ekspresi kompleksnya.Genetik Kebangsaan.49, 895–903 (2017).